阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種非常普遍的慢性睡眠障礙，以睡眠中反復(fù)發(fā)生的部分或完全咽部塌陷為特征，伴有慢性間歇性缺氧（CIH）。OSA被鑒定為是發(fā)生全身性高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大約50%的OSA患者有高血壓，估計(jì)有70-85%的頑固性高血壓患者有OSA。然而，OSA誘發(fā)高血壓的確切機(jī)制尚不完全清楚。越來(lái)越多的證據(jù)表明，以內(nèi)皮依賴性舒張功能受損為特征的血管內(nèi)皮功能障礙，是OSA中出現(xiàn)臨床上明顯的心血管并發(fā)癥之前血管損傷的最早跡象。因此，對(duì)CIH狀態(tài)下內(nèi)皮功能障礙的分子機(jī)制進(jìn)行整體分析，將有助于全面了解OSA或CIH相關(guān)性高血壓的發(fā)病機(jī)制。

氧化應(yīng)激通過(guò)促進(jìn)NO解偶聯(lián)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。抗氧化轉(zhuǎn)錄因子NRF2保留內(nèi)皮功能并防止Ang II誘導(dǎo)的高血壓。已有報(bào)道稱CIH通過(guò)抑制NRF2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)心肌損傷，但NRF2是否介導(dǎo)CIH相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙和高血壓尚不清楚。

細(xì)胞外囊泡（EVs）分泌進(jìn)入血液或其他體液中是發(fā)生在多細(xì)胞生物中的普遍細(xì)胞過(guò)程。EVs作為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，通過(guò)將復(fù)雜分子遞送給受體細(xì)胞來(lái)發(fā)揮多方面的功能，從而參與多種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞是已知的吸收EVs的主要細(xì)胞類型。與內(nèi)皮細(xì)胞直接和持續(xù)接觸的循環(huán)EVs可以被內(nèi)皮細(xì)胞吸收，從而影響血管生成、血管通透性和血管張力的調(diào)節(jié)。之前的研究表明，在糖尿病相關(guān)心肌梗死中，循環(huán)外泌體miR-144-3p抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移，進(jìn)而損害新血管形成。然而，很少有研究關(guān)注循環(huán)EVs對(duì)CIH相關(guān)內(nèi)皮功能障礙和高血壓的作用及詳細(xì)機(jī)制。

近日，Theranostics期刊在線發(fā)表了一篇題為Extracellular vesicle-derived miR-144 as a novel mechanism for chronic intermittent hypoxia-induced endothelial dysfunction的研究論文。報(bào)道了一種細(xì)胞外囊泡來(lái)源的miR-144作為慢性間歇性缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的新機(jī)制，暗示負(fù)載anti-miR-144的細(xì)胞外囊泡可能是治療阻塞性睡眠呼吸暫停或慢性間歇性缺氧相關(guān)內(nèi)皮功能障礙的一種有希望的方法。

首先，研究人員發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠經(jīng)過(guò)30天CIH處理后，嚴(yán)重減弱了其胸主動(dòng)脈和頸動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張（EDR），并顯著升高血壓 ，尤其是收縮壓，但在CIH處理后重新給予正常氧氣15天，這種影響被逆轉(zhuǎn)。為了確定CIH誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制，研究人員通過(guò)微陣列分析以鑒定C57BL/6小鼠在常氧（N）、CIH（C）和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）條件下主動(dòng)脈中的差異表達(dá)基因。結(jié)果在CIH與常氧小鼠中鑒定了743個(gè)顯著差異表達(dá)的編碼基因，其中只有NRF2與血管收縮和擴(kuò)張、活性氧（ROS）生成、炎癥和血管生成均相關(guān)。Western-blotting結(jié)果顯示，CIH暴露30天的C57BL/6小鼠的主動(dòng)脈中NRF2及其下游靶標(biāo) CATALASE（CAT）的水平顯著降低，并且在Re-Nor post-CIH組中恢復(fù)。此外，研究發(fā)現(xiàn)CIH處理的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中超氧化物的產(chǎn)生明顯增加。

Fig1. CIH處理會(huì)損害EDR、降低NRF2表達(dá)并促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生

為了探索CIH S-EVs對(duì)EDRs的影響，研究人員評(píng)估了S-EVs的特征。結(jié)果顯示，從正常C57BL/6小鼠中分離出的大多數(shù)S-EVs呈現(xiàn)出直徑約100nm的典型圓盤(pán)狀囊泡。EV標(biāo)志物，尤其是外泌體相關(guān)蛋白CD9、CD63、CD81、ALIX和TSG101在EV組分中富集。納米粒子追蹤分析顯示，300μL血清產(chǎn)生的S-EVs的平均尺寸為111.0±57.2 nm，而CIH S-EVs的數(shù)量約為常氧組（Nor S-EVs）的2倍。En face染色表明PKH67標(biāo)記的C57BL/6小鼠S-EV以時(shí)間依賴性方式被內(nèi)皮細(xì)胞吸收。

Fig2. 從C57BL/6小鼠血清中分離的細(xì)胞外囊泡可被主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞吸收

接著，研究人員發(fā)現(xiàn)直接暴露于CIH S-EVs 48h可減弱C57BL/6小鼠胸主動(dòng)脈中的EDR，并減少C57BL/6小鼠腸系膜動(dòng)脈中的血流介導(dǎo)性擴(kuò)張。聯(lián)合肝素（EV吸收阻斷劑）處理可逆轉(zhuǎn)CIH s -EV對(duì)小鼠主動(dòng)脈EDR的損害。為了進(jìn)一步確定CIH S-EVs如何對(duì)EDR產(chǎn)生不利影響，研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)錄組微陣列分析來(lái)鑒定CIH S-EVs或Nor S-EVs處理的HUVECs中的差異表達(dá)基因。結(jié)果鑒定出19個(gè)顯著差異表達(dá)的編碼基因，其中，Nrf2是CIH S-EV處理的HUVEC和CIH處理的小鼠主動(dòng)脈唯一共有的差異表達(dá)基因。進(jìn)一步的驗(yàn)證表明，CIH S-EV離體處理確實(shí)降低了NRF2及其靶點(diǎn)CAT在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞系H5V和小鼠主動(dòng)脈中的蛋白表達(dá)。此外，CIH S-EV處理48h可增加H5V細(xì)胞和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中超氧陰離子的產(chǎn)生。表明NRF2降低可能是導(dǎo)致CIH S-EV誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞超氧陰離子過(guò)度產(chǎn)生的主要分子。

Fig3. CIH S-EVs損害內(nèi)皮功能，增加超氧陰離子的產(chǎn)生，并降低內(nèi)皮細(xì)胞中NRF2的表達(dá)

為了確定CIH S-EVs降低NRF2和受損內(nèi)皮功能的機(jī)制，研究人員通過(guò)qPCR檢測(cè)了常氧和CIH處理的小鼠S-EVs中與氧化應(yīng)激或缺氧信號(hào)相關(guān)的幾個(gè)EV相關(guān)miRNAs。結(jié)果顯示，CIH S-EVs中miR-126的水平降低，而miR-132、miR-150、miR-27a和miR-144的水平升高。之前的研究表明在Nrf2的3′-UTR中存在miR-27a和miR-144a的保守結(jié)合序列，使用agomiR-144和agomiR-27a過(guò)表達(dá)miR-144和miR-27a會(huì)降低H5V中NRF2及其靶標(biāo)CAT的蛋白質(zhì)水平，并抑制293A細(xì)胞中Nrf2-3’UTR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。

此外，qPCR結(jié)果顯示，在間歇性缺氧（IH）處理24h后，成熟的miR-27a及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miR-27a（但不是miR-144或pri-miR-144）在H5V中被誘導(dǎo)，表明除miR-144外，miR-27a在內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)源性表達(dá)，并對(duì)IH刺激有反應(yīng)。在H5V細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到miR-144的表達(dá)，但CIH S-EV處理顯著增加了H5V細(xì)胞中miR-144的豐度。而無(wú)論是否用放線菌素D抑制內(nèi)源性miRNA的產(chǎn)生，這種效應(yīng)都持續(xù)存在，表明內(nèi)皮miR-144信號(hào)主要來(lái)自S-EVs。 因此，選擇EV miR-144作為進(jìn)一步研究的目標(biāo)分子。

Fig4. miR-144在CIH S-EVs中增加，并通過(guò)S-EVs遞送至內(nèi)皮細(xì)胞

由于miR-144主要在紅細(xì)胞中表達(dá)并參與紅系分化。為了闡明miR-144在CIH S-EV中的細(xì)胞來(lái)源，研究人員通過(guò)超離心從C57BL/6小鼠紅細(xì)胞中分離出紅細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（E-EVs），并對(duì)其進(jìn)行表征。結(jié)果顯示E-EVs呈現(xiàn)典型的圓盤(pán)形狀，平均直徑為115.0±50.9nm。此外，在E-EV組分中還觀察到紅細(xì)胞蛋白HBA。qPCR分析顯示miR-144在CIH處理的C57BL/6小鼠紅細(xì)胞和OSA患者紅細(xì)胞的E-EVs中顯著上調(diào)。

Fig5. E-EVs的表征和E-EVs中miR-144的表達(dá)

為了進(jìn)一步證明EV介導(dǎo)的紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，研究人員檢測(cè)了常氧、30天CIH或30天CIH后15天常氧條件（CIH-R-N）處理后C57BL/6小鼠紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中pri和成熟miR-144的水平。qPCR結(jié)果表明miR-144和pri-miR-144的表達(dá)在紅細(xì)胞中占優(yōu)勢(shì)，而不是在內(nèi)皮細(xì)胞中。CIH狀態(tài)下，pri-miR-144和miR-144在紅細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高，恢復(fù)常氧15天后趨勢(shì)逆轉(zhuǎn)；而在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中，只有miR-144被上調(diào)，表明內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-144極有可能從體內(nèi)紅細(xì)胞外源性轉(zhuǎn)移。接下來(lái)，研究人員通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)探索了缺氧狀態(tài)下紅細(xì)胞中miR-144的分子調(diào)控作用。結(jié)果表明，缺氧時(shí)miR-144可直接受HIF-1α調(diào)控或受HIF-1α/GATA1通路間接調(diào)控。

Fig6. 間歇性缺氧時(shí)紅細(xì)胞中miR-144的表達(dá)與調(diào)控

最后，為了進(jìn)一步驗(yàn)證CIH E-EVs遞送miR-144對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，研究人員使用anti-miR-144 和負(fù)載anti-miR-144的CIH E-EVs在體外治療主動(dòng)脈或在體內(nèi)治療CIH小鼠。結(jié)果顯示，負(fù)載anti-miR-144的CIH E-EV在孵育48h后并未增加H5V細(xì)胞中的miR-144水平，且H5V細(xì)胞中NRF2和CAT的蛋白質(zhì)水平保持在對(duì)照組中觀察到的水平。一致地，通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)行的體內(nèi)CIH E-EV治療可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中超氧陰離子的產(chǎn)生。然而，這種作用在負(fù)載anti-miR-144的CIH E-EV治療組中在很大程度上被抑制。同時(shí)，CIH E-EVs的體內(nèi)治療會(huì)損害常氧和CIH治療小鼠的EDR并增加收縮壓。這些影響在用anti-miR-144負(fù)載的CIH E-EVs治療組中降低。同樣，antagomiR-144顯著逆轉(zhuǎn)了由CIH小鼠或OSA患者E-EV引起的內(nèi)皮功能障礙。

Fig7. Anti-miR-144可逆轉(zhuǎn)CIH E-EV誘導(dǎo)的超氧陰離子過(guò)度產(chǎn)生、NRF2減少和內(nèi)皮功能障礙

總之，本研究系統(tǒng)地證明了CIH S-EV和CIH E-EV可以將功能性miR-144傳遞給內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)降低NRF2表達(dá)來(lái)促進(jìn)超氧陰離子的產(chǎn)生。該研究結(jié)果為負(fù)載anti-miR-144的EV或antagomir-144在治療OSA或CIH相關(guān)血管并發(fā)癥中的治療潛力提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

原文鏈接：https://www.thno.org/v12p4237.htm

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