riboEDIT? CRISPR-Cas9是銳博自主開發的采用天然復合物系統的即用型（Ready-to-Use）基因編輯體系，gRNA采用crRNA和tracrRNA，提供全RNA體系（crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA）和RNP體系（crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein），充分借助化學合成技術優勢和質譜檢測以確保質量穩定，通過化學轉染、顯微注射或電穿孔/電轉進行編輯，是大規模文庫篩選的理想選擇。該體系不需要自行構建gRNA載體或Cas9載體，無需病毒實驗室，無需前期測序鑒定，無DNA組分，不整合病毒或質粒基因，輕松實現單靶點或多靶點編輯，簡化基因編輯實驗步驟，數倍縮短實驗時間。銳博還提供編輯效率保證套裝和配套必需試劑，為基因編輯提供方便、省時、高效的解決方案。
體系優勢
銳博專利情況：用于DNA編輯的系統及其應用，中國專利申請號：108977442A， PCT申請號：CN2018/088105
1、銳博專利技術：優化的gRNA（crRNA與tracrRNA）和Cas9 mRNA
2、瞬時表達，有效降低脫靶率
3、無DNA組分，不整合任何病毒或質粒基因
4、編輯效率更高，適用于哺乳動物細胞
5、毒性更低，激活先天免疫反應更小，減少細胞死亡
6、允許一次轉染同時靶向編輯多個基因，且毒性更低
7、無需繁瑣的克隆構建過程，節約更多人力和時間
8、無需病毒級實驗室，大大降低基因編輯對實驗環境的要求
9、即用型體系，更加易用，更適合從小規模實驗到大規模高通量篩選
10、兼容多種導入模式：化學轉染（mRNA轉染/蛋白轉染）、電轉或電穿孔、顯微注射等
CRISPR-Cas9與RNAi的不同
RNAi又稱RNA干擾，來源于真核生物的免疫系統，它是在mRNA水平對目的基因進行沉默；CRISPR-Cas9來源于原核生物的免疫系統，它是從基因組水平對基因進行敲除，可完全消除目的基因在細胞內的表達，靶蛋白的功能也可能完全喪失，Cas9靶點選擇范圍可擴大到所有基因組序列。
CRISPR-Cas9：RNP體系、全基于mRNA的全RNA體系
設計合成crRNA：靶向目的DNA序列
riboEDIT? Designed crRNA采用銳博生物優化的生物信息學設計，客戶無需具備crRNA/sgRNA設計經驗，crRNA包含20個與目標DNA序列互補配對的核苷酸（原間隔序列）和與tracrRNA互補配對的重復序列，涵蓋人類和小鼠基因，每個基因設計合成3 – 6段單獨的sgRNA，經過嚴格的PAGE純化，其他物種crRNA設計需另行評估。
人源和小鼠設計合成crRNA每條的價格：1250元/5nmol, 1650元/10nmol，大規格定制請在線詢價，提供crRNA序列設計服務。
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通用型tracrRNA：與crRNA形成gRNA
riboEDIT tracrRNA采用化學合成通用型tracrRNA，經PAGE純化，能夠抗核酸酶，能與銳博生物的crRNA結合形成crRNA/tracrRNA復合物，共同指導Cas9蛋白切割雙鏈DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA與riboEDIT crRNA是專利配套體系，兩者必須配套使用（不兼容其他體系的crRNA）。
*訂購tracrRNA，請到本頁下方的“產品訂購”中加入購物車。
效率保證套裝/標準套裝: 用于篩選gRNA有效性
銳博生物提供方便高效的基因編輯套裝產品：效率保證套裝和標準套裝。效率保證套裝針對人源基因，利用設計軟件挑選評分高的5條crRNA進行合成，基于Cas9 mRNA的體系而配置必備試劑，包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA轉染試劑、陽性對照crRNA套裝、T7E1酶及配套緩沖液等，提供即用型的基因編輯套餐。其中效率保證套裝可以實現MHCC97H細胞的T7E1酶切效率至少1條達到30%以上并提供相應的售后服務，標準套裝不提供任何編輯效率的保證。
riboEDIT? CRISPR-Cas9套裝產品
| 產品名稱 | riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set, 20T? |
| 編輯效率保證套裝* | 套裝編號：crG00001，點擊開始定制 |
| 標準套裝 | 套裝編號：crS00001，點擊開始定制 |
?*效率保證裝：按說明書操作條件下，對MHCC97H細胞的T7E1酶切效率可實現至少1條達到30%以上，若5條均低于30%，客戶須提供MHCC97H轉染效率與檢測方法步驟，經技術分析確認,免費重新優化設計，挑選合成5條crRNA并提供實驗技術指導。標準套裝不提供編輯效率有效性保證和免費重合服務，更多信息請見說明書。
| 套裝名稱 | 套裝產品內容 |
| riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set （基于mRNA的全RNA體系/針對人源細胞） |
riboEDIT? Designed crRNA（設計合成5條crRNA，每條5nmol） riboEDIT? tracrRNA， 5nmol riboEDIT? Positive Control crRNA Validation Set for Human *,? 3*5nmol riboFECT? mRNA Transfection Reagent, 75ul riboEDIT? Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug riboEDIT? T7EI Enzyme (10U/ul), 100U |
**Positive Control crRNA Validation Set for Human包括針對人源的陽性對照crRNA 5nmol、正向引物5nmol和反向引物5nmol
CRISPR crRNA Library文庫
CRISPR crRNA文庫優勢
銳博優化算法設計crRNA，特異高效
每個靶點設計4條獨特的crRNA
靈活經濟定制，20個基因起訂
單孔或陣列細胞表型結果
每批經過PAGE純化和質譜檢測
提供凍存管或96孔板封裝
提供單條分裝或多條預混PreMix形式
無需使用者具備crRNA/sgRNA設計經驗
配套提供tracrRNA
riboEDIT CRISPR crRNA文庫一覽表
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crRNA陽性對照套裝：檢測編輯體系正確性
riboEDIT? crRNA陽性對照套裝用于檢測基因編輯體系的正確性，該套裝包括陽性對照crRNA、正向引物和反向引物，各5nmol。
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Cas9 mRNA：瞬時表達Cas9蛋白
riboEDIT Cas9 mRNA為體外轉錄生成，是屬于spCas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴結構，編碼序列為人源密碼子優化的S. pyogenes Cas9，帶有核定位信號（NLS），C端的一個1XFLAG標簽，5’非翻譯區(5’UTR)及3’非翻譯區(3’UTR)，以促進mRNA的翻譯和提高mRNA的穩定性，Cas9 mRNA可在細胞內瞬時表達Cas9蛋白（即spCas9蛋白），在crRNA和tracrRNA復合物指導下對目的DNA序列進行剪切，相比質粒或病毒體系，有效地降低CRISPR基因編輯的脫靶效應，適用于哺乳動物細胞基因編輯。
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Cas9蛋白
riboEDIT Cas9 Protein是riboEDIT CRISPR-Cas9的RNP體系的重要組成部分，RNP體系包括了crRNA和tracrRNA和Cas9蛋白，tracrRNA可實現大規模合成，靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成，Cas9蛋白為熱穩定S.pyogenes來源的核酸酶（又稱為spCas9）。此RNP體系不需要自行構建gRNA表達載體，無需在病毒級實驗室中操作，無DNA組分，并且可實現多個crRNA指導下的多靶點編輯，大大簡化前期實驗步驟。該即用型的RNP體系適合化學轉染（借助蛋白轉染試劑）、顯微注射或電轉（電穿孔）進行基因編輯。500pmol的Cas9蛋白相當于83ug，一般情況下每孔轉染1-2ug的Cas9蛋白，可轉染超過40次以上。
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T7E1 Enzyme酶：檢測編輯效率
riboEDIT T7EI Enzymes是經E.coli重組表達的結構特異性酶，可識別并切割非完全配對的雙鏈DNA、十字形結構DNA、 Holliday交叉DNA、異源雙鏈DNA，或緩慢地切割帶有切刻的雙鏈DNA；可有效識別大于1個堿基的基因錯配，廣泛應用于由CRISPR-Cas9、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介導的基因突變檢測。試劑盒提供了T7EI Enzyme、緩沖液和無酶水等組分。產品為低溫運輸，收到產品后，請于-20℃保存，可以穩定保存1年，使用前請瞬時離心。
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mRNA轉染試劑
riboFECT? mRNA Transfection Reagent是一種專門用于長鏈RNA分子的轉染試劑，極具生物相容性，轉染效率高，細胞毒性小，適合各種長鏈RNA分子（如mRNA，lncRNA等）的轉染實驗，可轉染的長鏈RNA長度達4kb，已經成功實現了幾十種細胞類型的高效轉染，包括原代細胞、干細胞等難以轉染的細胞類型。該轉染試劑的最大特點是低毒、高效，轉染時無需進行培養基更換操作，方便，快速。產品為常溫運輸。收到產品后，請于2-8℃保存，可以穩定保存一年，使用前請瞬時離心。
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EGFP mRNA：用于轉染對照，檢測轉染效率
riboEDIT EGFP mRNA在轉染試劑作用下進入目的細胞之后會表達綠色熒光EGFP蛋白，常作為檢測CRISPR-Cas9體系轉染效率的工具，提供的EGFP mRNA濃度為500ng/μL。
*訂購EGFP mRNA，請到本頁下方的“產品訂購”中加入購物車。
結果示例：riboEDIT? CRISPR-Cas9 mRNA與RNP體系編輯效率
riboEDIT? Cas9 Expression mRNA具有高效的基因組剪切效率
圖1. MHCC97H細胞共轉染10pmol riboEDIT? crRNA、10pmol riboEDIT? tracrRNA和1ug riboEDIT? Cas9 mRNA，48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示，#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。
riboEDIT?Cas9 RNP具有高效的基因組剪切效率
圖2. MHCC97H細胞共轉染6pmol riboEDIT? crRNA、6pmol riboEDIT? tracrRNA和6pmol riboEDIT? Cas9 Protein，48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示，#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。
圖3.? riboEDIT? CRISPR-Cas9 mRNA基因編輯體系與riboEDIT Cas9 RNP復合物具有等同的靶位點剪切活性。
應用領域
本體系可用于哺乳動物細胞的基因編輯，如腫瘤細胞、干細胞（動物胚胎干細胞、多功能干細胞、造血干細胞等）、原代細胞、祖細胞、細胞治療（CAR-T）、動物模型（受精卵）等，適合進行單/多基因敲除/插入、細胞改造、構建穩轉株、動物受精卵或干細胞，或從受精卵或配套注射進行模式動物構建。
CRISPR操作流程：Ready-To-Use，更簡單，步驟更少
常見問題解答（F&Q）
1. riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系的gRNA是何種形式的？是100nt的體外轉錄合成的gRNA嗎？
答：有研究者體外轉錄或克隆形成的single guide RNA（即sgRNA），長度約100 mer，通過搖菌培養、載體表達、挑選陽性克隆、測序鑒定等，或通過包病毒步驟，非常繁瑣，而且純度低、批次質量難以保證。而構建好的gRNA質粒、慢病毒、腺病毒會整合到宿主基因，載體體積大，免疫源性，轉染效率低、細胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。
riboEDIT CRIPSR-Cas9系統采用近兩年來被全球科學家越來越多采用的天然復合物gRNA，即crRNA和tracrRNA，無需體外轉錄，采用高通量化學合成以確保其純度、效力和批次穩定性。因不需要載體或病毒，上述問題可避免。其中，crRNA和tracrRNA為專利技術優化，縮短了堿基序列長度。不同于常規gRNA，由crRNA、tracrRNA與S. pyogenes Cas9（編碼序列經人源密碼子優化）構成編輯效率更高的CRISPR-Cas9體系，如下圖所示。
2. riboEDIT CRIPSR-Cas9體系相比于質粒載體表達Cas9和Cas9穩定表達細胞株或慢病毒系統有什么優勢？
答：（1）riboEDIT? CRIPSR-Cas9的全RNA體系或Cas9蛋白體系相比質粒載體或Cas9穩定表達細胞株而言，Cas9蛋白為瞬時表達，脫靶效率低、無DNA整合風險和啟動子兼容性問題，大大提高應用安全性。
（2）即用型體系，通過一步轉染，5-6個工作日即可完成編輯效率檢測，操作簡便，顯著縮短實驗周期。
（3）不需要自行構建載體或包裝慢病毒，不需要病毒級的實驗室環境。
（4）在大部分細胞中，比質粒表達載體具有更高的基因編輯效率。
3.使用riboEDIT Cas9 mRNA進行細胞基因編輯，如何確定細胞的轉染效率？
答：高轉染效率是獲得高效基因編輯效率的必要條件，可通過轉染EGFP mRNA （貨號：C11061-1）或其它熒光蛋白mRNA 來確定細胞的轉染效率。riboFECT mRNA轉染試劑可實現各種細胞類型，包括干細胞和原代細胞的高效率、低毒性轉染，從而提高Cas9 蛋白剪切和基因重組效率。對于轉染試劑難以達到理想轉染效果的細胞，推薦使用電轉、顯微注射等方式，具體實驗條件需要自行優化。
4.riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于顯微注射？
答：可以，riboEDIT Cas9 mRNA 濃度為0.5μg/μL，建議顯微注射前調整濃度到20-200ng/μL 范圍，并采用0.2μm針式過濾器確保去除所有可能堵塞顯微注射針頭的顆粒物或細菌。
5.如何快速確定crRNA的有效性？
答：crRNA/ tracrRNA 剪切效率與crRNA識別的靶序列有關，不同的crRNA剪切活性不同，推薦通過體外酶切實驗，在體外酶切靶DNA片段，快速篩選有效的crRNA，獲得高編輯效率的crRNA再進行后續的實驗。
6. riboEDIT? CRISPR-Cas9基因編輯系統識別的PAM序列是什么？
答： riboEDIT? Cas9 mRNA和riboEDIT? Cas9 Protein S. pyogenes Cas9為S. pyogenes Cas9，識別PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。
7. riboEDIT? Pre-designed crRNA如何保證低的脫靶效率？
答：從crRNA的設計角度，使用更嚴格的序列比對分析，建議每個基因至少設計3-6條crRNA進行有效性篩選。
8. T7EI酶切檢測編輯效率發現無剪切條帶是什么原因？
答：可能原因如下：
（1） 細胞轉染效率低，建議優化轉染步驟或換用容易轉染的細胞類型。
（2） Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通過設置陽性對照組（riboEDIT Positive Control crRNA #1，貨號crRP0001VS）共轉染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的問題。
（3） 在細胞內，Cas9核酸酶無法接近靶位點或無法剪切靶位點，建議重新設計crRNA。
（4） 沒有進行DNA片段的變性、退火步驟。可通過設置陽性對照組確認實驗操作是否有誤。
9. 瓊脂糖凝膠電泳分析剪切效率時非特異性條帶多，無法分析剪切效率怎么辦？
答：可通過設置陰性對照組來區分目標剪切條帶和非目標條帶。必要時，需重新設計引物，或通過優化PCR條件，來降低非特異性擴增。建議采用巢式PCR，提高擴增片段的特異性。
10. T7E1 突變檢測時，出現條帶彌散的現象，應該如何解決？
答: 由于T7E1 本身具有弱的非特異切割DNA 鏈的能力，所以遇到這種情況，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，減少酶切時間來降低非特異切割現象。
11.對于從事諸如干細胞、原代細胞或懸浮細胞，應該選擇哪一種riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系？
答: 干細胞、原代細胞或懸浮細胞等難轉染細胞，轉染試劑一般很難達到理想的轉染效果，電轉方式更適合這類細胞的轉染，根據目前文獻支持，Cas9 RNP體系用于電轉具有更高的基因編輯效率，對于上述難轉染的細胞推薦用riboEDIT? CRISPR/Cas9 RNP體系，具體實驗條件需要自行優化。
12.riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多個靶點或基因的編輯？
答：可以，通過混合多條crRNA與tracrRNA 和riboEDIT Cas9 mRNA 共轉染，可實現對多個靶點或基因的編輯，最佳共轉染體系需自行優化，請保證crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。
13.mRNA 轉染與DNA 轉染相比，有哪些優勢？
答：（1）DNA 轉染需要進入細胞核，對于快速分裂的細胞才能達到理想的轉染效果，而mRNA 轉染只需進入細胞質，可大大提高有絲分裂后細胞或緩慢分裂細胞的轉染效率。（2）沒有轉錄過程，蛋白表達更快速，縮短實驗周期。（3） 更加安全，無DNA 整合風險。
14.如何用riboFECT? mRNA Transfection Reagent 轉染Cas9 mRNA 和sgRNA 進行基因編輯？
答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 適用于轉染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的雙鏈DNA 或HDR 模板。尤其適用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共轉染進行基因編輯， 轉染步驟請參照《riboEDIT? CRISPR-Cas9 體系使用說明》實驗方法部分riboEDIT? CRISPR/Cas9 mRNA 操作說明。當利用CRISPR 做基因敲入，需自行優化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共轉染體系，以獲得最佳效果。
15.轉染過程中，細胞培養基內能否含有血清及雙抗？
答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的轉染試劑，血清的存在會影響轉染復合物的形成，請確保在孵育轉染復合物時使用的是無血清培養基。孵育結束后，轉染復合物可直接加入含有或不含有血清/雙抗的細胞培養基中，無需更換培養基，操作簡便。
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| 產品編號 | 產品名稱 | 目錄價 | 數量 | 操作 |
|---|---|---|---|---|
| C11055-1 | riboFECT mRNA Transfection Reagent, 75ul | ¥800.00 |
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主要參考文獻
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