阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種非常普遍的慢性睡眠障礙，以睡眠中反復發(fā)生的部分或完全咽部塌陷為特征，伴有慢性間歇性缺氧（CIH）。OSA被鑒定為是發(fā)生全身性高血壓的獨立危險因素。大約50%的OSA患者有高血壓，估計有70-85%的頑固性高血壓患者有OSA。然而，OSA誘發(fā)高血壓的確切機制尚不完全清楚。越來越多的證據(jù)表明，以內(nèi)皮依賴性舒張功能受損為特征的血管內(nèi)皮功能障礙，是OSA中出現(xiàn)臨床上明顯的心血管并發(fā)癥之前血管損傷的最早跡象。因此，對CIH狀態(tài)下內(nèi)皮功能障礙的分子機制進行整體分析，將有助于全面了解OSA或CIH相關性高血壓的發(fā)病機制。

氧化應激通過促進NO解偶聯(lián)導致內(nèi)皮功能障礙。抗氧化轉(zhuǎn)錄因子NRF2保留內(nèi)皮功能并防止Ang II誘導的高血壓。已有報道稱CIH通過抑制NRF2蛋白表達誘導心肌損傷，但NRF2是否介導CIH相關的內(nèi)皮功能障礙和高血壓尚不清楚。

細胞外囊泡（EVs）分泌進入血液或其他體液中是發(fā)生在多細胞生物中的普遍細胞過程。EVs作為細胞間通訊的重要介質(zhì)，通過將復雜分子遞送給受體細胞來發(fā)揮多方面的功能，從而參與多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)。內(nèi)皮細胞是已知的吸收EVs的主要細胞類型。與內(nèi)皮細胞直接和持續(xù)接觸的循環(huán)EVs可以被內(nèi)皮細胞吸收，從而影響血管生成、血管通透性和血管張力的調(diào)節(jié)。之前的研究表明，在糖尿病相關心肌梗死中，循環(huán)外泌體miR-144-3p抑制內(nèi)皮祖細胞的遷移，進而損害新血管形成。然而，很少有研究關注循環(huán)EVs對CIH相關內(nèi)皮功能障礙和高血壓的作用及詳細機制。

近日，Theranostics期刊在線發(fā)表了一篇題為Extracellular vesicle-derived miR-144 as a novel mechanism for chronic intermittent hypoxia-induced endothelial dysfunction的研究論文。報道了一種細胞外囊泡來源的miR-144作為慢性間歇性缺氧誘導的內(nèi)皮功能障礙的新機制，暗示負載anti-miR-144的細胞外囊泡可能是治療阻塞性睡眠呼吸暫停或慢性間歇性缺氧相關內(nèi)皮功能障礙的一種有希望的方法。

首先，研究人員發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠經(jīng)過30天CIH處理后，嚴重減弱了其胸主動脈和頸動脈的內(nèi)皮依賴性舒張（EDR），并顯著升高血壓 ，尤其是收縮壓，但在CIH處理后重新給予正常氧氣15天，這種影響被逆轉(zhuǎn)。為了確定CIH誘導內(nèi)皮功能障礙的機制，研究人員通過微陣列分析以鑒定C57BL/6小鼠在常氧（N）、CIH（C）和30天CIH后15天常氧（Re-Nor post-CIH）條件下主動脈中的差異表達基因。結(jié)果在CIH與常氧小鼠中鑒定了743個顯著差異表達的編碼基因，其中只有NRF2與血管收縮和擴張、活性氧（ROS）生成、炎癥和血管生成均相關。Western-blotting結(jié)果顯示，CIH暴露30天的C57BL/6小鼠的主動脈中NRF2及其下游靶標 CATALASE（CAT）的水平顯著降低，并且在Re-Nor post-CIH組中恢復。此外，研究發(fā)現(xiàn)CIH處理的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中超氧化物的產(chǎn)生明顯增加。

Fig1. CIH處理會損害EDR、降低NRF2表達并促進超氧陰離子的產(chǎn)生

為了探索CIH S-EVs對EDRs的影響，研究人員評估了S-EVs的特征。結(jié)果顯示，從正常C57BL/6小鼠中分離出的大多數(shù)S-EVs呈現(xiàn)出直徑約100nm的典型圓盤狀囊泡。EV標志物，尤其是外泌體相關蛋白CD9、CD63、CD81、ALIX和TSG101在EV組分中富集。納米粒子追蹤分析顯示，300μL血清產(chǎn)生的S-EVs的平均尺寸為111.0±57.2 nm，而CIH S-EVs的數(shù)量約為常氧組（Nor S-EVs）的2倍。En face染色表明PKH67標記的C57BL/6小鼠S-EV以時間依賴性方式被內(nèi)皮細胞吸收。

Fig2. 從C57BL/6小鼠血清中分離的細胞外囊泡可被主動脈內(nèi)皮細胞吸收

接著，研究人員發(fā)現(xiàn)直接暴露于CIH S-EVs 48h可減弱C57BL/6小鼠胸主動脈中的EDR，并減少C57BL/6小鼠腸系膜動脈中的血流介導性擴張。聯(lián)合肝素（EV吸收阻斷劑）處理可逆轉(zhuǎn)CIH s -EV對小鼠主動脈EDR的損害。為了進一步確定CIH S-EVs如何對EDR產(chǎn)生不利影響，研究人員通過轉(zhuǎn)錄組微陣列分析來鑒定CIH S-EVs或Nor S-EVs處理的HUVECs中的差異表達基因。結(jié)果鑒定出19個顯著差異表達的編碼基因，其中，Nrf2是CIH S-EV處理的HUVEC和CIH處理的小鼠主動脈唯一共有的差異表達基因。進一步的驗證表明，CIH S-EV離體處理確實降低了NRF2及其靶點CAT在小鼠內(nèi)皮細胞系H5V和小鼠主動脈中的蛋白表達。此外，CIH S-EV處理48h可增加H5V細胞和主動脈內(nèi)皮細胞中超氧陰離子的產(chǎn)生。表明NRF2降低可能是導致CIH S-EV誘導的內(nèi)皮細胞超氧陰離子過度產(chǎn)生的主要分子。

Fig3. CIH S-EVs損害內(nèi)皮功能，增加超氧陰離子的產(chǎn)生，并降低內(nèi)皮細胞中NRF2的表達

為了確定CIH S-EVs降低NRF2和受損內(nèi)皮功能的機制，研究人員通過qPCR檢測了常氧和CIH處理的小鼠S-EVs中與氧化應激或缺氧信號相關的幾個EV相關miRNAs。結(jié)果顯示，CIH S-EVs中miR-126的水平降低，而miR-132、miR-150、miR-27a和miR-144的水平升高。之前的研究表明在Nrf2的3′-UTR中存在miR-27a和miR-144a的保守結(jié)合序列，使用agomiR-144和agomiR-27a過表達miR-144和miR-27a會降低H5V中NRF2及其靶標CAT的蛋白質(zhì)水平，并抑制293A細胞中Nrf2-3’UTR驅(qū)動的熒光素酶活性。

此外，qPCR結(jié)果顯示，在間歇性缺氧（IH）處理24h后，成熟的miR-27a及其初級轉(zhuǎn)錄本pri-miR-27a（但不是miR-144或pri-miR-144）在H5V中被誘導，表明除miR-144外，miR-27a在內(nèi)皮細胞中內(nèi)源性表達，并對IH刺激有反應。在H5V細胞中幾乎檢測不到miR-144的表達，但CIH S-EV處理顯著增加了H5V細胞中miR-144的豐度。而無論是否用放線菌素D抑制內(nèi)源性miRNA的產(chǎn)生，這種效應都持續(xù)存在，表明內(nèi)皮miR-144信號主要來自S-EVs。 因此，選擇EV miR-144作為進一步研究的目標分子。

Fig4. miR-144在CIH S-EVs中增加，并通過S-EVs遞送至內(nèi)皮細胞

由于miR-144主要在紅細胞中表達并參與紅系分化。為了闡明miR-144在CIH S-EV中的細胞來源，研究人員通過超離心從C57BL/6小鼠紅細胞中分離出紅細胞來源的細胞外囊泡（E-EVs），并對其進行表征。結(jié)果顯示E-EVs呈現(xiàn)典型的圓盤形狀，平均直徑為115.0±50.9nm。此外，在E-EV組分中還觀察到紅細胞蛋白HBA。qPCR分析顯示miR-144在CIH處理的C57BL/6小鼠紅細胞和OSA患者紅細胞的E-EVs中顯著上調(diào)。

Fig5. E-EVs的表征和E-EVs中miR-144的表達

為了進一步證明EV介導的紅細胞和內(nèi)皮細胞之間的細胞間通訊，研究人員檢測了常氧、30天CIH或30天CIH后15天常氧條件（CIH-R-N）處理后C57BL/6小鼠紅細胞和內(nèi)皮細胞中pri和成熟miR-144的水平。qPCR結(jié)果表明miR-144和pri-miR-144的表達在紅細胞中占優(yōu)勢，而不是在內(nèi)皮細胞中。CIH狀態(tài)下，pri-miR-144和miR-144在紅細胞中的表達顯著升高，恢復常氧15天后趨勢逆轉(zhuǎn)；而在主動脈內(nèi)皮細胞中，只有miR-144被上調(diào)，表明內(nèi)皮細胞中的miR-144極有可能從體內(nèi)紅細胞外源性轉(zhuǎn)移。接下來，研究人員通過一系列實驗探索了缺氧狀態(tài)下紅細胞中miR-144的分子調(diào)控作用。結(jié)果表明，缺氧時miR-144可直接受HIF-1α調(diào)控或受HIF-1α/GATA1通路間接調(diào)控。

Fig6. 間歇性缺氧時紅細胞中miR-144的表達與調(diào)控

最后，為了進一步驗證CIH E-EVs遞送miR-144對內(nèi)皮細胞的影響，研究人員使用anti-miR-144 和負載anti-miR-144的CIH E-EVs在體外治療主動脈或在體內(nèi)治療CIH小鼠。結(jié)果顯示，負載anti-miR-144的CIH E-EV在孵育48h后并未增加H5V細胞中的miR-144水平，且H5V細胞中NRF2和CAT的蛋白質(zhì)水平保持在對照組中觀察到的水平。一致地，通過尾靜脈注射進行的體內(nèi)CIH E-EV治療可增強內(nèi)皮細胞中超氧陰離子的產(chǎn)生。然而，這種作用在負載anti-miR-144的CIH E-EV治療組中在很大程度上被抑制。同時，CIH E-EVs的體內(nèi)治療會損害常氧和CIH治療小鼠的EDR并增加收縮壓。這些影響在用anti-miR-144負載的CIH E-EVs治療組中降低。同樣，antagomiR-144顯著逆轉(zhuǎn)了由CIH小鼠或OSA患者E-EV引起的內(nèi)皮功能障礙。

Fig7. Anti-miR-144可逆轉(zhuǎn)CIH E-EV誘導的超氧陰離子過度產(chǎn)生、NRF2減少和內(nèi)皮功能障礙

總之，本研究系統(tǒng)地證明了CIH S-EV和CIH E-EV可以將功能性miR-144傳遞給內(nèi)皮細胞，通過降低NRF2表達來促進超氧陰離子的產(chǎn)生。該研究結(jié)果為負載anti-miR-144的EV或antagomir-144在治療OSA或CIH相關血管并發(fā)癥中的治療潛力提供了實驗證據(jù)。

原文鏈接：https://www.thno.org/v12p4237.htm

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