Hu抗原R（HUR）作為ELAV家族的成員，是最有名的RNA結(jié)合蛋白（RBP）之一，可以選擇性識別并結(jié)合富含腺苷酸/尿苷酸的元件（AREs）。AREs是哺乳動物細(xì)胞mRNA 3’UTR中腺苷酸尿苷酸富集區(qū)域，可介導(dǎo)mRNA的快速降解。HUR通過穩(wěn)定其mRNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)其靶基因，并參與細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生。
另一種常見的癌蛋白是熱休克蛋白90（HSP90），它是一種進(jìn)化上保守的分子伴侶蛋白，在應(yīng)激反應(yīng)中參與穩(wěn)定和激活蛋白。與正常組織相比，HSP90在腫瘤中過表達(dá)，其作為遺傳損傷緩沖劑的功能允許突變蛋白保留其功能，同時允許癌細(xì)胞耐受不平衡的微環(huán)境。
2020年6月29日，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院束永前教授課題組在Molecular Cancer（IF15.302）期刊上發(fā)表了題為Exosomal circSHKBP1 promotes gastric cancer progression via regulating the miR-582-3p/HUR/VEGF axis and suppressing HSP90 degradation的科研成果。發(fā)現(xiàn)circSHKBP1在GC患者的腫瘤和血清外泌體中均過表達(dá)，并且與晚期病理分期和較差的生存率相關(guān)。CircSHKBP1通過吸附miR-582-3p并誘捕HSP90來促進(jìn)體內(nèi)和體外的GC進(jìn)程。 為GC的發(fā)病機(jī)理提供了一個新的見解。
circSHKBP1調(diào)控胃癌進(jìn)展的作用示意圖
研究結(jié)果
1. 通過RNA-Seq鑒定GC中的circRNAs
通過對8個GC組織和8個匹配的相鄰正常組織的混合樣本進(jìn)行RNA-seq，研究人員總共鑒定出1445個不同的候選circRNAs，其中至少有2個獨特的反向剪接連接reads。與正常組織相比，癌組織與正常組織間共有119個circRNAs差異表達(dá)，其中5個circRNAs上調(diào)，114個下調(diào)。進(jìn)一步通過qRT-PCR分析了10對胃癌腫瘤和正常組織中前5個表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的circRNAs，發(fā)現(xiàn)circSHKBP1是胃癌中差異表達(dá)最大的circRNA。
研究發(fā)現(xiàn)circSHKBP1是由SHKBP1基因的第11、12外顯子反向剪接產(chǎn)生，Sanger測序和RNase R消化實驗也證實了circSHKBP1以環(huán)狀形式存在。隨后，研究人員通過qRT-PCR檢測了circSHKBP1在72個配對的GC組織和正常組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與匹配的正常組織相比，circSHKBP1在53個GC組織中表達(dá)上調(diào)。此外，研究人員還對152對胃癌患者的癌組織和正常組織進(jìn)行ISH檢測。發(fā)現(xiàn)circSHKBP1在GC組織中的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于匹配的正常組織，且circSHKBP1表達(dá)與晚期TNM分期、血管侵犯及預(yù)后不良相關(guān)。
體外實驗顯示，使用siRNA敲低circSHKBP1可顯著抑制GC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力；過表達(dá)circSHKBP1則得到相反的結(jié)果。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)外泌體circSHKBP1的增加是由于更多的circSHKBP1被裝載到外泌體中，而不是更多的外泌體被釋放。隨后，將提取的轉(zhuǎn)染了circSHKBP1質(zhì)粒的BGC823和HGC27細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體，與不同濃度未處理的GC細(xì)胞共培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)外泌體circSHKBP1的過表達(dá)也影響了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)了惡性細(xì)胞的表型。
為了研究circSHKBP1在GC細(xì)胞中的作用機(jī)制。研究人員首先通過FISH和核質(zhì)分離確定了circSHKBP1優(yōu)先定位于GC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。又通過RIP實驗證實了circSHKBP1可充當(dāng)miRNA海綿的作用。接著，預(yù)測了四個與circSHKBP1結(jié)合的潛在miRNA（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458），并且發(fā)現(xiàn)在circSHKBP1過表達(dá)的GC細(xì)胞中，miR-582-3p和miR-665的表達(dá)下調(diào)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蜕锼貥?biāo)記的RNA pulldown實驗證實了circSHKBP1與miR-582-3p直接相互作用。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-582-3p在GC腫瘤中的表達(dá)水平低于配對正常組織，且miR-582-3p與circSHKBP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明circSHKBP1作為miR-582-3p的海綿，降低了miR-582-3p的表達(dá)。進(jìn)一步的miR-582-3p生物學(xué)功能研究顯示miR-582-3p mimic抑制了GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而circSHKBP1的過表達(dá)則消除了這種抑制作用。
臨床數(shù)據(jù)分析顯示高circSHKBP1組的血管侵犯率明顯高于低circSHKBP1組。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了54個miR-582-3p候選靶蛋白，其中HUR和EIF2S1被報道為VEGF信號通路的一部分。VEGF是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要因素之一，因此研究人員對VEGF途徑進(jìn)行了深入研究。
western blot檢測顯示過表達(dá)circSHKBP1增加了HUR和VEGF的水平，但對EIF2S1的水平?jīng)]有影響。此外，miR-582-3p mimic可降低HUR和VEGF蛋白水平的升高。同樣，沉默circSHKBP1可以降低HUR和VEGF的水平，而miR-582-3p inhibitor可以恢復(fù)這些水平。HUR作為VEGF信號通路中的重要元件，可通過與VEGF mRNA的AREs結(jié)合，從而穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)VEGF翻譯。RIP實驗證實了HUR是miR-582-3p的靶點，并且HUR直接與VEGF mRNA結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)HUR表達(dá)與miR-582-3p負(fù)相關(guān)，與circSHKBP1正相關(guān)。
使用特異性生物素標(biāo)記的circSHKBP1探針進(jìn)行RNA pulldown發(fā)現(xiàn)circSHKBP1過表達(dá)GC細(xì)胞中有多條蛋白條帶富集。蛋白質(zhì)譜分析用于鑒別差異表達(dá)的蛋白，排名前2位的分別是HSP90β和HSP90α蛋白（HSP90的兩種亞型）。RIP實驗證實了circSHKBP1與HSP90直接相互作用。TCGA分析、qRT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)HSP90 mRNA和蛋白在胃癌中表達(dá)上調(diào)，且HSP90蛋白表達(dá)與circSHKBP1呈正相關(guān)。Western blotting顯示circSHKBP1過表達(dá)后HSP90總量略有增加。然而，用CHX抑制蛋白質(zhì)合成后，circSHKBP1過表達(dá)可顯著抑制HSP90的降解。
為了研究CircSHKBP1在體內(nèi)的功能，研究人員構(gòu)建了穩(wěn)定沉默circSHKBP1和穩(wěn)定過表達(dá)circSHKBP1的細(xì)胞株，然后將細(xì)胞皮下接種于裸鼠右大腿，密切監(jiān)測腫瘤生長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低circSHKBP1可限制腫瘤生長，無論是腫瘤體積還是腫瘤重量/體重比；過表達(dá)circSHKBP1使得產(chǎn)生的腫瘤更大、更重，而注射貝伐單抗可顯著抑制腫瘤生長。通過對小鼠血清和腫瘤中的蛋白進(jìn)行western blot分析，發(fā)現(xiàn)circSHKBP1沉默組的HUR和VEGF水平下降；circSHKBP1過表達(dá)組的HUR和VEGF升高，而貝伐單抗抑制VEGF。
