食道癌是一種全球致命的癌癥，5年總生存率為18%。食管癌的發(fā)病率、死亡率和組織病理學(xué)在不同的地理區(qū)域存在差異，特別是在東非/南非和東亞地區(qū)的居民負(fù)擔(dān)較高。腺癌和鱗狀細(xì)胞癌是兩種主要的組織學(xué)亞型，占食管癌的95%以上。在過去的幾十年中，這種癌癥的治療方法取得了一些進(jìn)展。目前，需要開發(fā)針對食管癌發(fā)生的新療法。
非編碼RNAs（ncRNAs）包括長鏈ncRNAs、microRNAs（miRNAs）、tRNA衍生的小RNAs、piwi相互作用RNAs和假基因在所有人類腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。最近，環(huán)狀RNAs（circRNAs）作為一種新興的內(nèi)源性ncRNAs亞群，可以作為癌癥細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。它們是通過pre-mRNA的反向剪接產(chǎn)生的，形成一個(gè)沒有5′-帽或3′-poly(A)尾的共價(jià)閉合環(huán)，并且由于其廣泛表達(dá)，相對較高的穩(wěn)定性，以及在唾液、血液和外泌體中大量存在，因此，具有成為癌癥診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。CircRNAs可以作為miRNA海綿來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)病機(jī)制，包括鱗狀細(xì)胞癌。大多數(shù)研究集中在circRNAs在正常情況下的生物學(xué)作用。 circRNAs在低氧條件下的生物發(fā)生和功能仍不清楚。缺氧會破壞正常組織的穩(wěn)態(tài)并重排腫瘤基質(zhì)的相互作用。在缺氧的情況下，腫瘤細(xì)胞變得更容易遷移。已有研究報(bào)道缺氧可誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。臨床上，腫瘤缺氧與對放療或化療的高耐藥性和預(yù)后不良有關(guān)。因此，探索缺氧條件下食管癌中的circRNAs具有重要意義。
鐵死亡是一種代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，是由胱氨酸缺失和脂質(zhì)活性氧（ROS）過度產(chǎn)生以鐵依賴性方式引起的，并與缺血性損傷和癌癥有關(guān)。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）通過還原谷胱甘肽（GSH）將脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇，從而保護(hù)細(xì)胞免受膜脂質(zhì)過氧化作用，并抑制鐵死亡。鐵死亡的形態(tài)學(xué)特征包括線粒體體積減少、線粒體嵴減少或缺失、線粒體外膜破裂、細(xì)胞核大小正常、無核濃縮，這與其他死亡模式有區(qū)別。由于癌細(xì)胞和正常細(xì)胞在鐵和脂質(zhì)代謝方面表現(xiàn)出生理差異以及異常的ROS產(chǎn)生，因此癌細(xì)胞可能比正常細(xì)胞更容易受到鐵死亡的調(diào)節(jié)。已獲批準(zhǔn)的藥物包括柳氮磺胺吡啶、索拉非尼、青蒿素和他汀類藥物可以誘導(dǎo)鐵死亡并抑制腫瘤生長。然而，鐵死亡作為一把雙刃劍，會在腫瘤微環(huán)境中引起免疫抑制，從而促進(jìn)腫瘤生長。先前的一項(xiàng)研究表明，易遷移的癌細(xì)胞對鐵死亡高度敏感。另一項(xiàng)研究表明，缺氧可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于鐵死亡。本研究揭示了食管癌細(xì)胞缺氧可激活鐵死亡，并探討了缺氧誘導(dǎo)的circRNA在鐵死亡中的作用及其潛在機(jī)制。
通過反向剪接反應(yīng)生成的circRNAs受到外顯子跳躍事件和RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的組合調(diào)控。RBPs包括ESRP1、ESRP2、PTBP1、TNPO1、RBM以及QKI，可以發(fā)揮剪接因子的功能來調(diào)節(jié)選擇性剪接。Quaking（QKI）屬于含KH結(jié)構(gòu)域的STAR家族，可以影響pre-mRNA的剪接。將QKI的共有結(jié)合序列引入到側(cè)翼內(nèi)含子會導(dǎo)致在正常情況下僅通過常規(guī)線性剪接的外顯子生成circRNAs。由于QKI可以形成二聚體，因此它被認(rèn)為靶向側(cè)翼內(nèi)含子并使環(huán)化的外顯子更靠近在一起，從而增加了circRNAs的生成。
近日，Molecular Cancer（IF41.444）期刊在線發(fā)表了題為CircBCAR3 accelerates esophageal cancer tumorigenesis and metastasis via sponging miR-27a-3p的研究論文。報(bào)道了一個(gè)在食管癌細(xì)胞中新鑒定的circRNA circBCAR3，其在食管癌組織和細(xì)胞中上調(diào)，并通過與miR-27a-3p結(jié)合上調(diào)TNPO1來加速食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。此外，E2F7誘導(dǎo)的剪接因子QKI促進(jìn)circBCAR3的生物發(fā)生。提示circBCAR3可能是食管癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
首先，研究人員從GEO數(shù)據(jù)庫中分析了circRNAs在食管癌中的表達(dá)。基于GSE150476和GSE112496數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)circRNAs在食管癌中差異表達(dá)。為了探索缺氧條件下食管癌中這些失調(diào)circRNAs的表達(dá)是否會發(fā)生改變，研究人員在缺氧處理后檢測了其在EC109細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧處理后hsa_circ_0007624（circBCAR3）表達(dá)上調(diào)。PCR證實(shí)了circBCAR3在食管腫瘤標(biāo)本和細(xì)胞系中表達(dá)明顯升高。隨后，研究人員對circBCAR3進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)circBCAR3是由BCAR3 pre-mRNA（基因組位置chr1:94047857–94057950）的2、3、4、5外顯子反向剪接形成的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。RNA-FISH顯示circBCAR3主要存在于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
Fig1. CircBCAR3在食管癌中表達(dá)上調(diào)
為了探討circBCAR3在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究人員進(jìn)行了功能缺失性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，沉默circBCAR3可抑制體外食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡。此外，缺氧處理可顯著促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和鐵死亡，而CircBCAR3敲低明顯逆轉(zhuǎn)了缺氧誘導(dǎo)的這些影響。
Fig2. 敲低circBCAR3可以在體外逆轉(zhuǎn)缺氧對食管癌細(xì)胞的影響
為了探索circBCAR3在體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用，研究人員構(gòu)建了小鼠食管癌異種移植模型。結(jié)果顯示，circBCAR3缺失可降低小鼠食管腫瘤的體積和重量。此外，研究人員還建立了腫瘤轉(zhuǎn)移模型，通過尾靜脈注射食管癌細(xì)胞來監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默circBCAR3可誘導(dǎo)小鼠腫瘤抑制，并且與對照組相比，沉默circBCAR3對食管癌肺轉(zhuǎn)移有抑制作用。HE染色進(jìn)一步證實(shí)了這一趨勢。表明敲低circBCAR3減弱了體內(nèi)食管腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
Fig3. 敲低circBCAR3抑制體內(nèi)食管癌生長和轉(zhuǎn)移
最后，研究人員通過生物信息學(xué)分析探索了circBCAR3的上游和下游機(jī)制，并通過RNA免疫沉淀和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circBCAR3可以通過競爭性內(nèi)源性RNA機(jī)制與miR-27a-3p相互作用，從而上調(diào)transportin-1（TNPO1）。此外，研究表明，剪接因子QKI是circBCAR3的正調(diào)節(jié)因子，通過靶向BCAR3 pre-mRNA中hsa_circ_0007624形成的外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)E2F7上調(diào)，E2F7在食管癌細(xì)胞中激活QKI的轉(zhuǎn)錄，QKI通過并置環(huán)狀外顯子來增加circBCAR3的形成。
Fig4. circBCAR3上游和下游機(jī)制模型示意圖
總之，本研究通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和鐵死亡以及促進(jìn)小鼠食管腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，創(chuàng)新性地證明了circBCAR3在食管癌中的致癌作用。在分子水平上，缺氧誘導(dǎo)的E2F7轉(zhuǎn)錄激活剪接因子QKI，其通過與形成circBCAR3的外顯子側(cè)翼的內(nèi)含子QKI反應(yīng)元件結(jié)合來促進(jìn)circBCAR3的生物發(fā)生。CircBCAR3與miR-27a-3p相互作用上調(diào)TNPO1，從而在食管癌細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。這些數(shù)據(jù)表明circBCAR3可作為食管癌研究和治療的潛在標(biāo)志物。
原文鏈接：
https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-022-01615-8#Sec23
本研究中使用到的miR-27a-3p mimic/inhibitor及其NC、EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒均由銳博生物提供！更多circRNA或miRNA研究產(chǎn)品與服務(wù)信息，歡迎登陸銳博生物官網(wǎng)（m.jyzfjx.com）進(jìn)行查詢或來電咨詢！
