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接下來(lái)，小編就給大家推薦兩個(gè)非常值得借鑒的m6A研究方案！
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研究方案Ⅰ
以腫瘤研究為例，依賴已有的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)或表達(dá)譜數(shù)據(jù)挖掘m6A修飾相關(guān)酶，對(duì)m6A修飾酶重要靶基因及功能進(jìn)行篩選，直接與臨床實(shí)際相關(guān)聯(lián)。
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1、篩選差異表達(dá)m6A修飾相關(guān)酶
實(shí)驗(yàn)方法：①使用TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)或高通量測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)m6A甲基化相關(guān)酶基因進(jìn)行差異分析、共表達(dá)分析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析及臨床相關(guān)性分析；②選擇合適的細(xì)胞模型（1株正常細(xì)胞+2株腫瘤細(xì)胞），qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)m6A修飾相關(guān)酶。
預(yù)期結(jié)果：篩選出5個(gè)差異表達(dá)m6A修飾相關(guān)酶基因。
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2、m6A修飾相關(guān)酶siRNA篩選及確認(rèn)細(xì)胞效應(yīng)
實(shí)驗(yàn)方法：①根據(jù)細(xì)胞活性、增殖情況等，選擇1株合適的細(xì)胞株；②選擇2個(gè)差異表達(dá)基因，使用不同siRNA處理細(xì)胞，檢測(cè)不同處理對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、耐藥等的影響。
預(yù)期結(jié)果：篩選對(duì)差異基因有效應(yīng)的siRNA。
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3、有效應(yīng)m6A Writer、Reader或Eraser沉默樣品MeRIP測(cè)序
實(shí)驗(yàn)方法：①選擇1個(gè)有效應(yīng)的m6A修飾相關(guān)酶基因，使用siRNA處理細(xì)胞制備loss-of-function樣品；②對(duì)loss-of-function樣品進(jìn)行MeRIP測(cè)序（3對(duì)樣品）。
預(yù)期結(jié)果：得到loss-of-function樣品的表達(dá)譜及修飾譜。
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4、生物信息學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)方法：①m6A甲基化peak及motif分析；②m6A修飾差異基因分析；③m6A甲基化與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)分析；④m6A甲基化與基因可變剪切分析；⑤m6A修飾與疾病相關(guān)性分析。
預(yù)期結(jié)果：確定20個(gè)表達(dá)發(fā)生變化或m6A修飾發(fā)生變化的下游基因作為潛在效應(yīng)靶點(diǎn)。
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5、候選相關(guān)基因高內(nèi)涵功能篩選
實(shí)驗(yàn)方法：①挑選20個(gè)候選基因，構(gòu)建候選相關(guān)基因siRNA文庫(kù)，選擇1株細(xì)胞；②對(duì)siRNA處理后的細(xì)胞進(jìn)行高通量高內(nèi)涵篩選，3復(fù)孔一塊板，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)表型。
預(yù)期結(jié)果：確認(rèn)模型中起重要作用的m6A修飾靶點(diǎn)，即能重現(xiàn)或拮抗m6A修飾相關(guān)酶作用的靶點(diǎn)。
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6、后續(xù)研究
? 下游基因m6A修飾的作用機(jī)制研究及更多效應(yīng)檢測(cè)；
? 大規(guī)模臨床樣品表達(dá)水平和m6A修飾驗(yàn)證及臨床意義分析。
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研究方案Ⅱ
不依賴表達(dá)譜數(shù)據(jù)，直接從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選有效應(yīng)m6A修飾相關(guān)酶入手，對(duì)疾病相關(guān)m6A修飾酶重要靶基因及功能進(jìn)行篩選。
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1、m6A修飾相關(guān)酶高通量高內(nèi)涵篩選
實(shí)驗(yàn)方法：①針對(duì)目前已確定的m6A修飾相關(guān)酶構(gòu)建siRNA文庫(kù)，選擇1株細(xì)胞；②對(duì)siRNA處理后的細(xì)胞進(jìn)行高通量高內(nèi)涵篩選，3復(fù)孔一塊板，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)表型。
預(yù)期結(jié)果：確定有細(xì)胞功能效應(yīng)的m6A修飾相關(guān)酶。
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2、有效應(yīng)m6A Writer、Reader或Eraser沉默樣品MeRIP測(cè)序
實(shí)驗(yàn)方法：①選擇1個(gè)有效應(yīng)的m6A修飾相關(guān)酶基因，使用siRNA處理細(xì)胞制備loss-of-function樣品；②對(duì)loss-of-function樣品進(jìn)行MeRIP測(cè)序（3對(duì)樣品）。
預(yù)期結(jié)果：得到loss-of-function樣品的表達(dá)譜及修飾譜。
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3、生物信息學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)方法：①m6A甲基化peak及motif分析；②m6A修飾差異基因分析；③m6A甲基化與基因表達(dá)關(guān)聯(lián)分析；④m6A甲基化與基因可變剪切分析；⑤m6A修飾與疾病相關(guān)性分析。
預(yù)期結(jié)果：確定20個(gè)表達(dá)發(fā)生變化或m6A修飾發(fā)生變化的下游基因作為潛在效應(yīng)靶點(diǎn)。
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4、候選相關(guān)基因高內(nèi)涵功能篩選
實(shí)驗(yàn)方法：①挑選20個(gè)候選基因，構(gòu)建候選相關(guān)基因siRNA文庫(kù)，選擇1株細(xì)胞；②對(duì)siRNA處理后的細(xì)胞進(jìn)行高通量高內(nèi)涵篩選，3復(fù)孔一塊板，同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)表型。
預(yù)期結(jié)果：確認(rèn)模型中起重要作用的m6A修飾靶點(diǎn)，即能重現(xiàn)或拮抗m6A修飾相關(guān)酶作用的靶點(diǎn)。
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5、后續(xù)研究
? 下游基因m6A修飾的作用機(jī)制研究及更多效應(yīng)檢測(cè)；
? 大規(guī)模臨床樣品表達(dá)水平和m6A修飾驗(yàn)證及臨床意義分析。
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針對(duì)以上m6A研究方案，銳博生物均可提供整體科研服務(wù)，歡迎咨詢！方案中涉及到的MeRIP-Seq技術(shù)服務(wù)，是利用單克隆抗體抓取存在m6A修飾的RNA片段，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組學(xué)范圍內(nèi)的m6A peak 檢測(cè)與motif分析。
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銳博MeRIP-Seq技術(shù)特色
? 平臺(tái)完整：MeRIP實(shí)驗(yàn)+建庫(kù)測(cè)序分析+MeRIP qPCR 一站式服務(wù)
? 高成功率：成功開展超過(guò)1000例樣本，支持低至ng級(jí)別RNA建庫(kù)
? 靈活選擇：先進(jìn)的建庫(kù)技術(shù)，采用NEB進(jìn)口試劑，建庫(kù)方式和文庫(kù)片段大小可選
? 重復(fù)性好：豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，已進(jìn)行多樣本間的比較分析
MeRIP-Seq結(jié)果示例
客戶代表性文章
[1] Wang H, Hu X, Huang M, et al. Mettl3-mediated mRNA m6A methyl ation promotes dendritic cell activation[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1898.
[2] Li T, Hu P S, Zuo Z, et al. METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma[J]. Molecular cancer, 2019, 18(1): 112.
[3] Ma L, Chen T, Zhang X, et al. The m6A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function[J]. Redox biology, 2021, 38: 101801.
[4] Wei H, Pu J, W ang J, et al. IGF2BP2 promotes Liver Cancer growth through an m6A-FEN1-dependent mechanism[J]. Frontiers in Oncology, 2020, 10: 2377.
