乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一。盡管在診斷和聯(lián)合治療方面取得了進(jìn)展，但乳腺癌患者的預(yù)后仍然不令人滿意。轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，這極大地阻礙了治療的成功。因此，更全面地了解乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于改善乳腺癌患者的預(yù)后具有重要意義。

近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNAs參與了各種生理和病理過(guò)程，特別是在癌癥中。LncRNAs是具有200多個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，沒有蛋白質(zhì)編碼潛能。已被證實(shí)lncRNAs在癌癥中經(jīng)常失調(diào)，并參與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。LncRNA ANCR被發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)EZH2的降解，從而減弱乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力。此外，發(fā)現(xiàn)lncRNA AGAP2-AS1在乳腺癌中被上調(diào)，并與曲妥珠單抗耐藥有關(guān)。然而，絕大多數(shù)lncRNAs在乳腺癌調(diào)控中的臨床意義和生物學(xué)機(jī)制仍然未知。

多項(xiàng)研究表明，LncRNAs可能作為ceRNAs發(fā)揮調(diào)節(jié)microRNAs生物學(xué)功能或表達(dá)的作用。例如，lncRNA LINC00963通過(guò)在乳腺癌細(xì)胞中充當(dāng)miR-324-3p的ceRNA來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生和抗輻射性。LncRNA NONHSAT101069通過(guò)有效充當(dāng)miR-129-5p的ceRNA，從而調(diào)節(jié)Twist1的抑制作用，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，以及對(duì)表柔比星的耐藥性。之前的研究表明，缺氧是腫瘤微環(huán)境的主要標(biāo)志之一，與許多實(shí)體腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。HIF-1α是一個(gè)廣泛研究的缺氧誘導(dǎo)因子（HIF），通過(guò)下游靶基因的反式激活介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)。在常氧條件下，HIF-1α受到蛋白酶體降解，而低氧條件下則保護(hù)HIF-1α不被降解，從而使HIF-1α易位到細(xì)胞核中以啟動(dòng)基因表達(dá)。近年來(lái)，低氧條件在調(diào)節(jié)lncRNAs表達(dá)中的作用已受到廣泛關(guān)注，并且各種缺氧反應(yīng)性lncRNAs在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中起重要作用。然而，在缺氧介導(dǎo)異常lncRNA表達(dá)的機(jī)制以及l(fā)ncRNA在乳腺癌中的功能方面還有待進(jìn)一步研究。

為了解決以上科學(xué)問(wèn)題，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院楊其峰教授課題組近日在Molecular Cancer（IF10.679）期刊上發(fā)表了題為L(zhǎng)ncRNA BCRT1 promotes breast cancer progression by targeting miR-1303/PTBP3 axis的研究論文。揭示了LncRNA BCRT1通過(guò)靶向miR-1303/PTBP3軸促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的作用機(jī)制，為乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了新的見解。暗示lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

文章的大致研究思路是這樣的：

以上實(shí)驗(yàn)方法涉及的相關(guān)產(chǎn)品或服務(wù)銳博生物均可以提供！

首先，研究者使用GSE112848和TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析lncRNA表達(dá)譜以鑒定可能參與乳腺癌進(jìn)展的重要lncRNAs，并且主要關(guān)注上調(diào)的lncRNAs，因?yàn)檫@些lncRNAs可能作為治療靶點(diǎn)或預(yù)后生物標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA BCRT1是乳腺癌組織中顯著上調(diào)的lncRNAs之一，沒有蛋白編碼潛能。RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lncRNA BCRT1在乳腺癌組織中明顯過(guò)表達(dá)。此外，高表達(dá)lncRNA BCRT1與較短的無(wú)病生存期(DFS)和總生存期(OS)顯著相關(guān)。核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)和FISH實(shí)驗(yàn)顯示lncRNA BCRT1主要位于細(xì)胞質(zhì)。

體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA BCRT1可顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力；而過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1則顯著增加乳腺癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，并顯著增加體內(nèi)腫瘤的大小和體積，以及肺轉(zhuǎn)移病灶的體積和數(shù)量。表明lncRNA BCRT1對(duì)于促進(jìn)乳腺癌的增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用。

由于lncRNA BCRT1主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)中，研究者推測(cè)lncRNA BCRT1可能充當(dāng)miRNA海綿，阻止miRNA與其靶mRNA結(jié)合，并通過(guò)RegRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)、熒光素酶報(bào)告基因分析、RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-1303是lncRNA BCRT1的潛在靶點(diǎn)。

接著，研究者探索了miR-1303在乳腺癌中的作用。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-1303 mimics可降低乳腺癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲，增加細(xì)胞凋亡。重要的是，拯救實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了lncRNA BCRT1與miR-1303之間的功能關(guān)系。

隨后，通過(guò)miRDB、miRWalk、miRPathDB和TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)，研究者發(fā)現(xiàn)PTBP3是miR-1303的潛在靶標(biāo)，并且使用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)PTBP3在乳腺癌組織中的表達(dá)升高，而高表達(dá)PTBP3與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)。此外，PTBP3在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與lncRNA BCRT1的表達(dá)呈正相關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-1303或敲低lncRNA BCRT1可降低PTBP3 mRNA和蛋白水平。挽救實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-1303可以部分抵消lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)引起的乳腺癌細(xì)胞中PTBP3表達(dá)的增加。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了PTBP3是miR-1303的直接靶點(diǎn)。

為了確定PTBP3在乳腺癌中的作用，研究者敲低PTBP3發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞增殖顯著被抑制，細(xì)胞凋亡增加，此外乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲減弱。表明PTBP3在乳腺癌中起著腫瘤啟動(dòng)子的作用，并且lncRNA BCRT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1303對(duì)PTBP3的表達(dá)起到了重要的調(diào)控作用。

為了確定lncRNA BCRT1是否有助于M2極化，研究者檢測(cè)了lncRNA BCRT1在非極化巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)lncRNA BCRT1在M2巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高，暗示了lncRNA BCRT1在巨噬細(xì)胞極化中的潛在作用。另外，敲低lncRNA BCRT1可導(dǎo)致M2標(biāo)記物顯著降低；而過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1則得到相反的結(jié)果，并且lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的上清液也會(huì)導(dǎo)致M2標(biāo)記物的表達(dá)升高。

然后，研究者試圖探究乳腺癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的通訊調(diào)節(jié)機(jī)制。由于許多研究報(bào)道了lncRNAs可以通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。因此研究者從乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，以確定lncRNA BCRT1是否能被外泌體包裹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中LncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致分泌的外泌體中LncRNA BCRT1水平升高，而LncRNA BCRT1敲低則產(chǎn)生相反的結(jié)果，說(shuō)明外泌體中存在lncRNA BCRT1。隨后，對(duì)乳腺癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體進(jìn)行標(biāo)記，并與巨噬細(xì)胞一起培養(yǎng)，證實(shí)了標(biāo)記的外泌體RNAs可被巨噬細(xì)胞吸收。接著，將lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞分離的外泌體與未極化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)lncRNA BCRT1和M2表型標(biāo)志物表達(dá)顯著升高，暗示外泌體lncRNA BCRT1促進(jìn)了M2極化。此外，lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞分離的外泌體或上清液處理巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)了細(xì)胞遷移和血管生成。以上結(jié)果表明lncRNA BCRT1可以通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)M2表型極化并增強(qiáng)其腫瘤促進(jìn)功能。

接下來(lái)，為了研究lncRNA BCRT1是否為缺氧敏感的lncRNA，研究者對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行了缺氧或常氧處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著HIF-1α表達(dá)的增加，lncRNA BCRT1的表達(dá)明顯升高。而敲低HIF-1α極大地減弱了缺氧誘導(dǎo)的lncRNA BCRT1上調(diào)。為了闡明缺氧誘導(dǎo)lncRNA BCRT1上調(diào)的潛在機(jī)制，研究者分析了JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)，在lncRNA BCRT1啟動(dòng)子中鑒定出兩個(gè)假定的HIF-1α反應(yīng)元件（HRE），并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了HRE1對(duì)lncRNA BCRT1的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α與lncRNA BCRT1啟動(dòng)子中的兩個(gè)預(yù)測(cè)HRE結(jié)合，并且lncRNA BCRT1啟動(dòng)子中的HRE1是介導(dǎo)HIF-1α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要區(qū)域。以上結(jié)果表明缺氧是通過(guò)HIF-1α與lncRNA BCRT1啟動(dòng)子上的HRE1直接結(jié)合從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控lncRNA BCRT1的表達(dá)。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個(gè)標(biāo)志，與各種實(shí)體腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)。因此，研究者需要確定lncRNA BCRT1是否參與了缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧處理導(dǎo)致lncRNA BCRT1和PTBP3表達(dá)增加，與細(xì)胞增殖增強(qiáng)一致。敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1減弱了缺氧誘導(dǎo)的作用，而過(guò)表達(dá)lncRNA BCRT1部分逆轉(zhuǎn)了HIF-1α敲低的抑制作用。此外，缺氧處理后，乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出更多成纖維細(xì)胞樣形態(tài)并且遷移能力增強(qiáng)，而敲低HIF-1α或lncRNA BCRT1可顯著逆轉(zhuǎn)這一狀態(tài)。另外，lncRNA BCRT1過(guò)表達(dá)明顯挽救了低氧條件下siHIF-1α抑制的EMT圖譜。以上結(jié)果表明，lncRNA BCRT1可能參與了缺氧誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。

總的來(lái)說(shuō)，研究結(jié)果揭示了用于乳腺癌進(jìn)展的新的HIF-1α/ lncRNA BCRT1 / miR-1303 / PTBP3途徑，并表明lncRNA BCRT1可能是乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

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