N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物細胞中最普遍的mRNA修飾。然而，m6A在特定致癌長鏈非編碼RNAs（ncRNAs）上的疾病相關(guān)功能尚不清楚。為此，天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院牛遠杰課題組在Molecular Cancer期刊上發(fā)表了題為Long non-coding RNA NEAT1 promotes bone metastasis of prostate cancer through N6-methyladenosine的研究論文。揭示了ncRNA NEAT1-1上的m6A在調(diào)節(jié)Pol II ser2磷酸化中起關(guān)鍵作用，預(yù)示其可能是骨轉(zhuǎn)移癌治療和診斷的新特異性靶點。并且新復(fù)合物CYCLINL1/CDK19/ NEAT1-1可能為骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌發(fā)病和發(fā)展的潛在機制提供新的見解。

?

本研究主要實驗結(jié)果：

?

? ?NEAT1-1 m6A水平在前列腺癌中升高并且是患者的不良預(yù)后因素

?

NEAT1-1作為一種致癌ncRNA在多種癌癥中高表達。為了研究NEAT1-1 m6A修飾在臨床病理相關(guān)背景下的作用，研究人員從鄰近正常癌、原發(fā)癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和骨轉(zhuǎn)移癌新鮮樣本中獲取m6A抗體免疫沉淀的RNA。箱線圖分析顯示骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌樣本中NEAT1-1 m6A水平顯著高于原發(fā)性前列腺癌或癌旁正常樣本。Kaplan-Meier生存分析顯示高水平的NEAT1–1或NEAT1–1 m6A與前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生存期和原發(fā)性前列腺癌患者的總生存期較短有關(guān)。

? ?在前列腺癌的NEAT1-1中鑒定出四個m6A位點

m6A位點通常位于mRNA的3’UTR。為了在NEAT1-1上確定真正的m6A位點，研究人員通過m6A RIP-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在NEAT1變體1（NEAT1-1）上有4個高峰值，而在NEAT1變體2（NEAT1-2）的其他區(qū)域有低信號。因此，研究人員重點關(guān)注了NEAT1-1的m6A，并按照NEAT1-1的5’-3’依次將m6A位點標(biāo)記為#1到#4。CLIP-PCR分析發(fā)現(xiàn)在前列腺癌P-18細胞中，所有四個位點的m6A信號均顯著高于相鄰位點。

? ?NEAT1-1通過m6A位點#4與CYCLINL1相互作用

為了發(fā)現(xiàn)NEAT1-1上m6A的分子功能，研究人員生成了NEAT1-1-1野生型（WT）和m6A缺失突變質(zhì)粒。質(zhì)譜分析顯示NEAT1-1 WT（而不是m6A突變型）結(jié)合多種蛋白，包括CYCLINL1。有趣的是，通過GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)了多種與轉(zhuǎn)移相關(guān)的途徑，包括與細胞外泌體、髓鞘和核纖層蛋白絲相關(guān)的途徑。pull down和western blot實驗也證實了只有CYCLINL1與NEAT1-1結(jié)合。

為了確定m6A在與CYCLINL1相互作用中的作用，研究人員敲低了P-18細胞中的m6A writer METTL3。CLIP分析發(fā)現(xiàn)在P-18細胞中CYCLINL1與NEAT1-1相關(guān)，但在METTL3敲除的P-18細胞中則與NEAT1-1不相關(guān)。進一步的RNA pull-down實驗顯示只有#4 m6A位點突變阻止了與CYCLINL1的結(jié)合。此外，#4 m6A位點介導(dǎo)了NEAT1-1與CYCLINL1的相互作用。表明NEAT1-1在前列腺PDX原代細胞中是通過其#4 m6A位點與CYCLINL1相互作用。

? ?NEAT1-1是連接CYCLINL1和CDK19的“橋梁”

質(zhì)譜分析顯示NEAT1-1與CYCLINL1和CDK19相互結(jié)合。為了證明CYCLINL1或CDK19與NEAT1-1之間的直接或間接結(jié)合，研究人員通過RBRDetector搜索了CYCLINL1和CDK19中潛在的RNA結(jié)合殘基(RBR)。發(fā)現(xiàn)CDK19中有一個GxxGxG結(jié)構(gòu)域，CYCLINL1中有四個富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域，都是潛在的RNA識別基序(RRMs)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)GxxGxG結(jié)構(gòu)域的缺失阻斷了CDK19和NEAT1-1的相互作用，并且CYCLINL1 C末端兩個富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域是其與NEAT1-1相互作用所必需的。

為了進一步確定細胞內(nèi)的NEAT1-1結(jié)合區(qū)域，研究人員通過iCLIP進行了相互作用分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEAT1-1在1-600nt內(nèi)與CDK19結(jié)合；NEAT1-1在3100-3756 nt內(nèi)與CYCLINL1結(jié)合。RNA EMSA顯示CDK19與NEAT1-1 1-600 nt中獨特的U-rich結(jié)構(gòu)域（487-493 nt）相關(guān)，CYCLINL1與NEAT1-1 3100-3756 nt內(nèi)的m6A結(jié)構(gòu)域相關(guān)。Co-IP實驗表明，RNA的破壞抑制了CYCLINL1和CDK19之間的相互作用。表明NEAT1-1是連接CYCLINL1和CDK19的橋梁。

?

? ?NEAT1-1在體外和前列腺癌中通過m6A激活pol II Ser2磷酸化

CDK19可調(diào)節(jié)RNA聚合酶II（RNPII）介導(dǎo)基因表達。本研究發(fā)現(xiàn)CDK19可在P-18中被NEAT1-1下拉。為了檢測CDK19、NEAT1-1和CYCLINL1復(fù)合物的活性，研究人員通過體外RNPII磷酸化實驗發(fā)現(xiàn)加入NEAT1-1可激活Ser2中的RNPII磷酸化，并且通過siRNAs和ASOs敲低P-18中的NEAT1-1阻止了Ser2中的RNPII磷酸化，但沒有阻止Ser5。此外，NEAT1–1的缺失會導(dǎo)致RNPII Ser2磷酸化的下調(diào)，NEAT1-1 WT可增加RNPII ser2磷酸化，但是#4突變則沒有。表明NEAT1-1通過#4 m6A位點激活了RNPII Ser-2磷酸化。

? ?NEAT1-1通過m6A位點＃4在RUNX2啟動子上募集CYCLINL1和CDK19

為了尋找CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1復(fù)合物的靶基因，研究人員通過RNA-seq發(fā)現(xiàn)了5166個可以通過刪除NEAT1-1和刪除NEAT1-1位點#4 m6A來調(diào)節(jié)的靶基因。其中部分靶基因為骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，如RUNX2。接下來，研究人員通過DNATriplex預(yù)測發(fā)現(xiàn)NEAT1-1可能與RUNX2的啟動子相互作用。ChIRP 實驗證實了NEAT1-1與RUNX2的啟動子在?200nt~?50nt區(qū)域相互作用。

為了探索NEAT1-1是否將CYCLINL1或CDK19募集到RUNX2的啟動子上，研究人員通過ChIP實驗檢測了CYCLINL1的結(jié)合。結(jié)果顯示通過CRISPR系統(tǒng)將NEAT1-1刪除和NEAT1-1 ＃4 m6A-mut挽救后，阻斷了CYCLINL1與RUNX2啟動子的結(jié)合。此外，過表達NEAT1-1 WT增加了RUNX2 RNA和蛋白水平，而NEAT1-1 m6A #4突變未能上調(diào)RUNX2 RNA和蛋白水平。表明#4 m6A位點通過RNA-DNA相互作用促使NEAT1–1將CYCLINL1和CDK9募集到RUNX2啟動子上。

? ?NEAT1-1通過m6A促進前列腺PDX生長

為了研究NEAT1-1 m6A在體內(nèi)的功能，研究人員使用異種移植模型來確定NEAT1-1的m6A調(diào)節(jié)對前列腺PDXs生長和轉(zhuǎn)移的影響程度。結(jié)果顯示過表達NEAT1-1 WT降低了小鼠的生存期，也增加了對骨盆骨和/或肺部轉(zhuǎn)移的可能性。此外，NEAT1-1 WT能促進P-18和P-34 PDXs的側(cè)翼腫瘤生長，而不是NEAT1–1 #4 m6A突變體。在NEAT1-1 WT過表達的側(cè)腹腫瘤中，RUNX2 RNA和蛋白水平均明顯更高。表明NEAT1-1 WT上調(diào)了RNPII Ser2的磷酸化水平以及RUNX2 RNA和蛋白水平，但m6A突變組則不能。由此可見，NEAT1-1 m6A可在小鼠PDX模型中促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

總之，本研究在ncRNA中發(fā)現(xiàn)了新的m6A功能，其在骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌中發(fā)揮致癌作用，并且與不良預(yù)后相關(guān)。進一步的實驗表明，NEAT1-1 m6A促進了新復(fù)合物CYCLINL1/CDK19對Pol II Ser2磷酸化的致癌作用。研究結(jié)果表明，ncRNA m6A在調(diào)節(jié)前列腺癌的進展中起著至關(guān)重要的作用，并且可能是癌癥治療和診斷的新靶標(biāo)。涉及新復(fù)合物CYCLINL1/CDK19/NEAT1-1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能會為骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌的發(fā)病機制和發(fā)展的潛在機制提供新的見解。

原文鏈接：

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01293-4#Sec35