了解非編碼RNAs（ncRNAs）在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用，將為鑒定診斷和治療靶點(diǎn)建立新的途徑。2019年5月17日，四川大學(xué)華西醫(yī)院吳泓、曾勇組在Cancer Research期刊上發(fā)表了題為L(zhǎng)ncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop的研究成果。該研究鑒定出lncRNA SNHG10及其同源snoRNA SCARNA13作為HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移的新驅(qū)動(dòng)因子。揭示了LncRNA SNHG10通過(guò)正反饋環(huán)調(diào)節(jié)其同源物SCARNA13促進(jìn)肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。

研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是中國(guó)第四大常見(jiàn)惡性腫瘤和第三大癌癥死因。然而HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全闡明，因此鑒定關(guān)鍵的促癌分子將有助于理解HCC發(fā)病機(jī)制和鑒定潛在的治療靶點(diǎn)。近年來(lái)，lncRNAs和小RNAs之間的復(fù)雜相互作用被揭示，其中一些lncRNAs可以產(chǎn)生或調(diào)節(jié)小RNAs。SNHGs（小核仁RNA宿主基因）的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子在細(xì)胞核內(nèi)可被加工成snoRNAs，而外顯子被剪接成lncRNAs并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，表明snoRNAs與SNHGs轉(zhuǎn)錄的同源lncRNAs之間可能存在潛在的相關(guān)性。然而，這些lncRNAs和同源snoRNAs之間的特定關(guān)系以及它們?cè)谀[瘤發(fā)生中的特定作用卻知之甚少。

研究結(jié)果

1.?SNHG10和SCARNA13在肺轉(zhuǎn)移灶和HCC組織中高表達(dá)，與HCC患者預(yù)后不良有關(guān)?

為了鑒定參與HCC轉(zhuǎn)移的ncRNA，研究人員利用RNA-seq比較異種移植的HCC細(xì)胞和親本HCC細(xì)胞之間的表達(dá)譜，并進(jìn)一步通過(guò)TCGA LIHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析以及交叉分析鑒定出24個(gè)lncRNAs和6個(gè)snoRNAs可能在HCC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。其中SNHG10和SCARNA13是來(lái)自相同初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本的不同產(chǎn)物。更具體地，SCARNA13是由SNHG10基因的初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子加工而成，而外顯子被剪接到SNHG10轉(zhuǎn)錄本中，表明SNHG10和SCARNA13可能協(xié)同促進(jìn)HCC的發(fā)生和進(jìn)展。因此，重點(diǎn)專注于lncRNA SNHG10及其同源物SCARNA13。

隨后，研究人員通過(guò)對(duì)TCGA LIHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析以及對(duì)臨床64對(duì)HCC組織及其相鄰正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，HCC組織中SNHG10和SCARNA13的水平均升高，并且它們之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的正相關(guān)。此外，Kaplan-Meier分析顯示SNHG10或SCARNA13的高表達(dá)與總體生存率較差顯著相關(guān)。

接著，在HCC細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或敲低SNHG10會(huì)導(dǎo)致SCARNA13的表達(dá)顯著的增加或減少，而SCARNA13的缺失不影響SNHG10的表達(dá)。表明SNHG10可能是SCARNA13的上游調(diào)控因子。

2.?SNHG10和SCARNA13促進(jìn)HCC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移?

為了闡明SNHG10在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的致癌作用，研究人員檢測(cè)了SNHG10對(duì)細(xì)胞表型的影響。發(fā)現(xiàn)SNHG10的缺失顯著抑制HCC細(xì)胞周期和增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，SNHG10的沉默大大減弱了HCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，SNHG10缺失組中腫瘤的體積和重量顯著降低，表明SNHG10在體內(nèi)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞的致瘤性。此外，研究人員評(píng)估了SNHG10對(duì)HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。通過(guò)肝/肺轉(zhuǎn)移檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LV-shSNHG10組小鼠的肝/肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度顯著下降，表明SNHG10增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的肝/肺轉(zhuǎn)移潛能。HE染色顯示LV-shSNHG10組的轉(zhuǎn)移灶在肺和肝組織切片中顯著降低。而過(guò)表達(dá)SNHG10則得到相反的結(jié)果。表明SNHG10在HCC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起致癌驅(qū)動(dòng)因子的作用。

由于SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時(shí)上調(diào)。同樣地，研究人員發(fā)現(xiàn)與SNHG10相似，SCARNA13的敲低極大地抑制了細(xì)胞周期和增殖，并誘導(dǎo)了HCC細(xì)胞的凋亡。此外，SCARNA13的下調(diào)顯著損害了HCC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。這些結(jié)果將SCARNA13鑒定為HCC中的致癌啟動(dòng)子。

3.?轉(zhuǎn)錄因子c-Myb上調(diào)SNHG10和SCARNA13水平?

為了確定SNHG10和SCARNA13在HCC中表達(dá)升高的潛在機(jī)制，研究人員通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了9個(gè)可能與SNHG10基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的TFs。隨后，TCGA LIHC數(shù)據(jù)集的分析表明，在9個(gè)TFs中，c-Myb表達(dá)與SNHG10和SCARNA13表達(dá)的相關(guān)性最高。因此，推斷c-Myb可能導(dǎo)致SNHG10和SCARNA13表達(dá)升高。正如預(yù)期一樣，敲低c-Myb可顯著降低HCC細(xì)胞中SNHG10和SCARNA13的表達(dá)，表明c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上游調(diào)節(jié)因子。

接著，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了SNHG10啟動(dòng)子區(qū)域有5個(gè)c-Myb結(jié)合位點(diǎn)（MBS）。隨后的ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了c-Myb顯著富集在SNHG10啟動(dòng)子區(qū)域中的MBS1和MBS3上。為了進(jìn)一步確定SNHG10基因啟動(dòng)子上c-Myb的轉(zhuǎn)錄激活，用SNHG10啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因和c-Myb siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)c-Myb的缺失顯著降低了SNHG10啟動(dòng)子活性。這些數(shù)據(jù)表明c-Myb可以直接結(jié)合SNHG10的啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致HCC細(xì)胞中SNHG10和SCARNA13的上調(diào)。

4.?SNHG10作為miR-150-5p海綿可增加c-Myb表達(dá)?

從理論上來(lái)看，snoRNAs和同源lncRNAs分別位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。FISH實(shí)驗(yàn)（FISH探針/試劑盒由銳博生物提供）也證實(shí)了SNHG10主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，而SCARNA13優(yōu)先位于細(xì)胞核中。接下來(lái)，研究人員探索了SNHG10調(diào)節(jié)SCARNA13表達(dá)的具體機(jī)制。生物信息學(xué)分析表明miR-150-5p可以結(jié)合SNHG10的309-315nt位點(diǎn)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示miR-150-5p和SNHG10在Ago2免疫沉淀物中均顯著富集，表明SNHG10存在于基于Ago2的miRNA誘導(dǎo)的抑制復(fù)合物中，并與miR-150-5p相關(guān)。

隨后，針對(duì)SNHG10設(shè)計(jì)10個(gè)ChIRP探針（ChIRP探針設(shè)計(jì)合成由銳博生物提供），通過(guò)ChIRP實(shí)驗(yàn)以確定SNHG10和miR-150-5p之間的直接相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-150-5p強(qiáng)烈富集在SNHG10上。此外，miR-150-5p mimic顯著抑制了pmirGLO-SNHG10的熒光素酶活性，而突變型則無(wú)影響，證實(shí)了SNHG10對(duì)miR-150-5p具有海綿作用。

大量研究表明c-Myb是miR-150-5p的直接靶點(diǎn)，miR-150-5p過(guò)表達(dá)可使c-Myb mRNA和蛋白水平下調(diào)。而之前的研究證明c-Myb可以直接上調(diào)SNHG10的表達(dá)。基于SNHG10對(duì)miR-150-5p的海綿作用，研究人員推斷SNHG10介導(dǎo)的miR-150-5p的螯合可能對(duì)c-Myb的上調(diào)至關(guān)重要。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上調(diào)SNHG10后，c-Myb的表達(dá)增加，而miR-150-5p mimics完全消除了這一效應(yīng)。相反，SNHG10敲低后，c-Myb的表達(dá)下降并被miR-150-5p海綿徹底挽救。

這些研究結(jié)果表明，SNHG10作為miR-150-5p的海綿，可以降低其對(duì)c-Myb的抑制作用，進(jìn)而增強(qiáng)c-Myb的表達(dá)。此外，SNHG10和c-Myb可能形成正反饋環(huán)以維持HCC中SNHG10的高表達(dá)。

5.?SNHG10通過(guò)miR-150-5p/RPL4-c-Myb正反饋環(huán)調(diào)節(jié)SCARNA13的表達(dá)?

為了闡明c-Myb是否在SNHG10對(duì)SCARNA13的調(diào)節(jié)作用中不可或缺，研究人員進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，LV-SNHG10細(xì)胞中SCARNA13的表達(dá)顯著升高，當(dāng)轉(zhuǎn)染c-Myb siRNA后，SCARNA13的表達(dá)仍高于對(duì)照，暗示SNHG10可能不僅僅通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myb的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)SCARNA13。miR-150-5p inhibitor可使LV-Control細(xì)胞中SCARNA13的表達(dá)顯著升高，當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-150-5p inhibitor和c-Myb siRNA后， SCARNA13的表達(dá)無(wú)明顯變化，證實(shí)了c-Myb完全介導(dǎo)了miR-150-5p對(duì)SCARNA13表達(dá)的調(diào)控作用。因此，可以看出c-Myb的表達(dá)水平是SNHG10過(guò)表達(dá)導(dǎo)致SCARNA13上調(diào)的部分原因。

接下來(lái)，為了評(píng)估RPL4對(duì)HCC細(xì)胞中c-Myb功能活性的正調(diào)節(jié)作用，構(gòu)建了含有c-Myb識(shí)別元件（MREs）的熒光素酶報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)RPL4可以增強(qiáng)MREs的活性。此外，Co-IP測(cè)定確定了RPL4與c-Myb之間的相互作用。最后，進(jìn)一步的挽救實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)染c-Myb siRNA和RPL4 siRNA后，LV-SNHG10細(xì)胞中SCARNA13的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化。

研究結(jié)果表明SNHG10一方面通過(guò)吸附miR-150-5p，另一方面通過(guò)與RPL4相互作用增強(qiáng)c-Myb的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)促進(jìn)c-Myb的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)SCARNA13的表達(dá)。

6.?SCARNA13通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9介導(dǎo)SNHG10驅(qū)動(dòng)HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移?

基于SNHG10和SCARNA13協(xié)同促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性表型和SNHG10調(diào)節(jié)SCARNA13的表達(dá)，可以推斷出SNHG10對(duì)HCC細(xì)胞的腫瘤促進(jìn)作用可能是由SCARNA13介導(dǎo)的。因此，SCARNA13 ASO轉(zhuǎn)染LVSNHG10細(xì)胞顯著挽救了SNHG10過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。這些結(jié)果表明，SCARNA13介導(dǎo)了SNHG10的腫瘤促進(jìn)功能。

詳情請(qǐng)查閱原文：

Lan T, Yuan K, Yan X, et al. LncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop[J]. Cancer research, 2019: canres. 4044.2018.