CRISPR-Cas9常見問題解答（FAQ），助您輕松解決實驗困惑！

CRISPR-Cas9作為目前最常使用的基因編輯系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確修飾。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。然而，在基因編輯實驗中我們卻經(jīng)常會被一些問題所困擾，特別是對于新手小白來說。下面小編就以riboEDIT? CRISPR-Cas9為例，匯總了基因編輯實驗中常見的一些問題解答，希望可以對正在或即將要進行CRISPR-Cas9基因編輯實驗的各位小伙伴們有所幫助！

riboEDIT? CRISPR-Cas9是銳博生物自主開發(fā)的采用天然復(fù)合物系統(tǒng)的即用型(Ready-to-Use)基因編輯體系，gRNA采用crRNA和tracrRNA，提供全RNA體系(crRNA+tracrRNA+Cas9 mRNA)和RNP體系(crRNA+tracrRNA+Cas9 Protein)，充分借助化學合成技術(shù)優(yōu)勢和質(zhì)譜檢測以確保質(zhì)量穩(wěn)定，通過化學轉(zhuǎn)染、顯微注射或電穿孔/電轉(zhuǎn)進行編輯，是大規(guī)模文庫篩選的理想選擇。該體系不需要自行構(gòu)建gRNA載體或Cas9載體，無需病毒實驗室，無需前期測序鑒定，無DNA組分，不整合病毒或質(zhì)粒基因，輕松實現(xiàn)單靶點或多靶點編輯，簡化基因編輯實驗步驟，數(shù)倍縮短實驗時間。還提供編輯效率保證套裝和配套必需試劑，為基因編輯提供方便、省時、高效的解決方案。

常見問題解答（FAQ）

1. riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系的gRNA是何種形式的？是100nt的體外轉(zhuǎn)錄合成的gRNA嗎？??

答：體外轉(zhuǎn)錄或克隆形成的single guide RNA（即sgRNA），長度約100 mer，需經(jīng)歷搖菌培養(yǎng)、載體表達、挑選陽性克隆、測序鑒定等，或通過包病毒步驟，非常繁瑣。構(gòu)建好的gRNA質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒會整合到宿主基因，載體體積大，免疫源性，轉(zhuǎn)染效率低、細胞毒性大、死亡率高、激活先天免疫等。

riboEDIT CRIPSR-Cas9系統(tǒng)采用近兩年來被全球科學家越來越多采用的天然復(fù)合物gRNA，即crRNA和tracrRNA，無需體外轉(zhuǎn)錄，采用高通量化學合成以確保其純度、效力和批次穩(wěn)定性。因不需要載體或病毒，上述問題可避免。其中，crRNA和tracrRNA為專利技術(shù)優(yōu)化，縮短了堿基序列長度。不同于常規(guī)gRNA，由crRNA、tracrRNA與S. pyogenes Cas9（編碼序列經(jīng)人源密碼子優(yōu)化）構(gòu)成編輯效率更高的CRISPR-Cas9體系，如下圖所示。

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2.?riboEDIT CRIPSR-Cas9體系相比于質(zhì)粒載體表達Cas9和Cas9穩(wěn)定表達細胞株或慢病毒系統(tǒng)有什么優(yōu)勢？??

答：riboEDIT? CRIPSR-Cas9的全RNA體系或Cas9蛋白體系相比質(zhì)粒載體或Cas9穩(wěn)定表達細胞株而言具有以下優(yōu)勢：

（1）Cas9蛋白為瞬時表達，脫靶效率低、無DNA整合風險和啟動子兼容性問題，大大提高應(yīng)用安全性。

（2）即用型體系，通過一步轉(zhuǎn)染，5-6個工作日即可完成編輯效率檢測，操作簡便，顯著縮短實驗周期。

（3）不需要自行構(gòu)建載體或包裝慢病毒，不需要病毒級的實驗室環(huán)境。

（4）在大部分細胞中，比質(zhì)粒表達載體具有更高的基因編輯效率。

3.?使用riboEDIT Cas9 mRNA進行細胞基因編輯，如何確定細胞的轉(zhuǎn)染效率？??

答：高轉(zhuǎn)染效率是獲得高效基因編輯效率的必要條件，可通過轉(zhuǎn)染EGFP mRNA或其它熒光蛋白mRNA 來確定細胞的轉(zhuǎn)染效率。riboFECT mRNA轉(zhuǎn)染試劑可實現(xiàn)各種細胞類型，包括干細胞和原代細胞的高效率、低毒性轉(zhuǎn)染，從而提高Cas9 蛋白剪切和基因重組效率。對于轉(zhuǎn)染試劑難以達到理想轉(zhuǎn)染效果的細胞，推薦使用電轉(zhuǎn)、顯微注射等方式，具體實驗條件需要自行優(yōu)化。

4.?riboEDIT Cas9 mRNA以及crRNA、trarcRNA是否可以用于顯微注射？??

答：可以，riboEDIT Cas9 mRNA 濃度為0.5μg/μL，建議顯微注射前調(diào)整濃度到20-200ng/μL 范圍，并采用0.2μm針式過濾器確保去除所有可能堵塞顯微注射針頭的顆粒物或細菌。

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5.?如何快速確定crRNA的有效性？??

答：crRNA/ tracrRNA 剪切效率與crRNA識別的靶序列有關(guān)，不同的crRNA剪切活性不同，推薦通過體外酶切實驗，在體外酶切靶DNA片段，快速篩選有效的crRNA，獲得高編輯效率的crRNA再進行后續(xù)的實驗。

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6.?riboEDIT? CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)識別的PAM序列是什么？??

答：riboEDIT? Cas9 mRNA和riboEDIT? Cas9 Protein S. pyogenes Cas9為S. pyogenes Cas9，識別PAM序列NGG，N代表A，T，C，G。

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7.?riboEDIT? Pre-designed crRNA如何保證低的脫靶效率？??

答：從crRNA的設(shè)計角度，使用更嚴格的序列比對分析，建議每個基因至少設(shè)計3-6條crRNA進行有效性篩選。

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8.?T7EI酶切檢測編輯效率發(fā)現(xiàn)無剪切條帶是什么原因？??

答：可能原因如下：

（1）細胞轉(zhuǎn)染效率低，建議優(yōu)化轉(zhuǎn)染步驟或換用容易轉(zhuǎn)染的細胞類型。

（2）Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解，可通過設(shè)置陽性對照組（riboEDIT Positive Control crRNA #1，貨號crRP0001VS）共轉(zhuǎn)染和排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解的問題。

（3）在細胞內(nèi)，Cas9核酸酶無法接近靶位點或無法剪切靶位點，建議重新設(shè)計crRNA。

（4）沒有進行DNA片段的變性、退火步驟。可通過設(shè)置陽性對照組確認實驗操作是否有誤。

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9.?瓊脂糖凝膠電泳分析剪切效率時非特異性條帶多，無法分析剪切效率怎么辦？??

答：可通過設(shè)置陰性對照組來區(qū)分目標剪切條帶和非目標條帶。必要時，需重新設(shè)計引物，或通過優(yōu)化PCR條件，來降低非特異性擴增。建議采用巢式PCR，提高擴增片段的特異性。

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10.?T7E1 突變檢測時，出現(xiàn)條帶彌散的現(xiàn)象，應(yīng)該如何解決？??

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特異切割DNA 鏈的能力，所以遇到這種情況，可以增加DNA 用量，降低酶的用量，減少酶切時間來降低非特異切割現(xiàn)象。

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11.?對于從事諸如干細胞、原代細胞或懸浮細胞，應(yīng)該選擇哪一種riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系？??

答: 干細胞、原代細胞或懸浮細胞等難轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染試劑一般很難達到理想的轉(zhuǎn)染效果，電轉(zhuǎn)方式更適合這類細胞的轉(zhuǎn)染，根據(jù)目前文獻支持，Cas9 RNP體系用于電轉(zhuǎn)具有更高的基因編輯效率，對于上述難轉(zhuǎn)染的細胞推薦用riboEDIT? CRISPR/Cas9 RNP體系，具體實驗條件需要自行優(yōu)化。

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12.?riboEDIT Cas9 mRNA 是否可以用于多個靶點或基因的編輯？??

答：可以，通過混合多條crRNA與tracrRNA 和riboEDT Cas9 mRNA 共轉(zhuǎn)染，可實現(xiàn)對多個靶點或基因的編輯，最佳共轉(zhuǎn)染體系需自行優(yōu)化，請保證crRNA 和tracrRNA 按1:1 加入。

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13.?mRNA 轉(zhuǎn)染與DNA 轉(zhuǎn)染相比，有哪些優(yōu)勢？??

答：（1）DNA 轉(zhuǎn)染需要進入細胞核，對于快速分裂的細胞才能達到理想的轉(zhuǎn)染效果，而mRNA 轉(zhuǎn)染只需進入細胞質(zhì)，可大大提高有絲分裂后細胞或緩慢分裂細胞的轉(zhuǎn)染效率。（2）沒有轉(zhuǎn)錄過程，蛋白表達更快速，縮短實驗周期。（3）更加安全，無DNA 整合風險。

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14.?如何用riboFECT? mRNA Transfection Reagent 轉(zhuǎn)染Cas9 mRNA 和sgRNA 進行基因編輯？??

答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 適用于轉(zhuǎn)染mRNA、 lncRNA、CRISPR sgRNA 或crRNA/tracrRNA、siRNA、miRNA、小于1kb 的雙鏈DNA 或HDR 模板。尤其適用于Cas9 mRNA 和crRNA/tracrRNA 共轉(zhuǎn)染進行基因編輯，轉(zhuǎn)染步驟請參照《riboEDIT? CRISPR-Cas9 體系使用說明》實驗方法部分riboEDIT? CRISPR/Cas9 mRNA 操作說明。當利用CRISPR 做基因敲入，需自行優(yōu)化Cas9 mRNA、crRNA/tracrRNA 及HDR 模板共轉(zhuǎn)染體系，以獲得最佳效果。

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15.?轉(zhuǎn)染過程中，細胞培養(yǎng)基內(nèi)能否含有血清及雙抗？??

答：riboFECT? mRNA Transfection Reagent 是一款低毒、高效的轉(zhuǎn)染試劑，血清的存在會影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，請確保在孵育轉(zhuǎn)染復(fù)合物時使用的是無血清培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后，轉(zhuǎn)染復(fù)合物可直接加入含有或不含有血清/雙抗的細胞培養(yǎng)基中，無需更換培養(yǎng)基，操作簡便。

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