mRNA可瞬時表達所需的蛋白質(zhì)，并且沒有插入突變的風險，已經(jīng)成為基因組編輯的強有力工具。相比于傳統(tǒng)方法（質(zhì)粒和病毒載體），通過mRNA進行基因編輯可避免許多諸如核酸酶的持續(xù)表達、或由于質(zhì)粒和病毒的整合而無意激活先前沉默的基因組位點的風險。
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CRISPR/Cas9作為目前最常使用的基因編輯系統(tǒng)，在crRNA和tracrRNA復合物（guide RNA）指導下，可將mRNA瞬時表達的Cas9蛋白靶向目標位點以進行DNA切割。銳博生物科學家團隊基于豐富的合成經(jīng)驗，自主開發(fā)了采用天然復合物系統(tǒng)的全RNA CRISPR-Cas9基因編輯體系！
圖1. 全RNA體系工作示意圖
全RNA體系具有如下特點：
? 自主專利技術，優(yōu)化的gRNA（crRNA與tracrRNA）和Cas9 mRNA
? 瞬時表達，有效降低脫靶率
? 編輯效率更高，適用于哺乳動物細胞
? 毒性更低，激活先天免疫反應更小，減少細胞死亡
? 即用型（Ready-to-Use），更加易用，適合從小規(guī)模實驗到大規(guī)模高通量篩選
? 兼容多種導入模式：化學轉(zhuǎn)染（mRNA轉(zhuǎn)染）、電轉(zhuǎn)或電穿孔、顯微注射等
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全RNA體系可提供基因編輯效率保證套裝：
銳博生物可針對人源基因提供方便高效的基因編輯效率保證套裝產(chǎn)品，利用設計軟件挑選評分高的5條crRNA進行合成，基于Cas9 mRNA的體系而配置必備試劑，包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA轉(zhuǎn)染試劑、陽性對照crRNA套裝、T7E1酶及配套緩沖液等。可以實現(xiàn)MHCC97H細胞的T7E1酶切效率至少1條達到30%以上并提供相應的售后服務。
| riboEDIT CRISPR-Cas9效率保證套裝產(chǎn)品 | |
| 套裝名稱 | 套裝產(chǎn)品內(nèi)容 |
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riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set （基于mRNA的全RNA體系/針對人源細胞） |
??riboEDIT Designed crRNA（設計合成5條crRNA，每條5nmol） ??riboEDIT tracrRNA， 5nmol ??riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human *,? 3*5nmol ??riboFECT mRNA Transfection Reagent, 75ul ??riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug ??riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul), 100U |
*效率保證套裝：按說明書操作條件下，對MHCC97H細胞的T7E1酶切效率可實現(xiàn)至少1條達到30%以上，若5條均低于30%，客戶須提供MHCC97H轉(zhuǎn)染效率與檢測方法步驟，經(jīng)技術分析確認，免費重新優(yōu)化設計，挑選合成5條crRNA并提供實驗技術指導。
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? crRNA設計合成：靶向目的DNA序列??
riboEDIT Designed crRNA采用優(yōu)化的生物信息學設計，包含20個與目標DNA序列互補配對的核苷酸（原間隔序列）和與tracrRNA互補配對的重復序列，涵蓋人類和小鼠基因（其他物種需評估），每個基因設計合成3-6段單獨的sgRNA，經(jīng)過嚴格的PAGE純化。
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? 通用型tracrRNA：與crRNA形成gRNA ?
riboEDIT tracrRNA采用化學合成通用型tracrRNA，經(jīng)PAGE純化，能夠抗核酸酶，能與crRNA結(jié)合形成crRNA/tracrRNA復合物，共同指導Cas9蛋白切割雙鏈DNA。需要注意的是，riboEDIT tracrRNA與riboEDIT crRNA是專利配套體系，兩者必須配套使用（不兼容其他體系的crRNA）。
? Cas9 mRNA：瞬時表達Cas9蛋白??
riboEDIT Cas9 mRNA為體外轉(zhuǎn)錄生成，采用優(yōu)化的加帽技術可實現(xiàn)高效且經(jīng)濟的共轉(zhuǎn)錄加帽以生成Ribo-Cap1結(jié)構(gòu)，從而提高mRNA活性并降低免疫原性。此外，還針對IVT mRNA結(jié)構(gòu)元件（5’UTR、3’UTR、編碼區(qū)和poly A尾）進行了優(yōu)化，使得優(yōu)化后的mRNA結(jié)構(gòu)系統(tǒng)地提高了其胞內(nèi)穩(wěn)定性和翻譯效率。
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Cas9 mRNA可在細胞內(nèi)瞬時表達Cas9蛋白，在crRNA和tracrRNA復合物指導下對目的DNA序列進行剪切，相比質(zhì)粒或病毒體系，有效地降低CRISPR基因編輯的脫靶效應，適用于哺乳動物細胞基因編輯。
圖2. riboEDIT Cas9 Expression mRNA具有高效的基因組剪切效率
MHCC97H細胞共轉(zhuǎn)染10pmol riboEDIT crRNA、10pmol riboEDIT tracrRNA和1ug riboEDIT Cas9 mRNA，48小時后 riboEDIT T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示，#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。
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? T7E1 Enzyme酶：檢測編輯效率??
riboEDIT T7EI Enzymes是經(jīng)E.coli重組表達的結(jié)構(gòu)特異性酶，可識別并切割非完全配對的雙鏈DNA、十字形結(jié)構(gòu)DNA、 Holliday交叉DNA、異源雙鏈DNA，或緩慢地切割帶有切刻的雙鏈DNA；可有效識別大于1個堿基的基因錯配，廣泛應用于由CRISPR-Cas9、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)等工程核酸酶所介導的基因突變檢測。
圖3. Agilent 2200 Tape Station檢測T7EI酶切后的DNA片段
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| 產(chǎn)品訂購信息 | |||
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 目錄價 | |
| crG00001 | riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Guarantee Set, 20T（基因編輯效率保證套裝） | ￥15,990.00 | |
| CR-NRA-1 | riboEDIT Designed crRNA（設計合成crRNA） | 詢價 | |
| crT00001-5 | riboEDIT tracrRNA, 5nmol | ￥628.00 | |
| C11057-1 | riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug | ￥2,950.00 | |
| C11054-1 | riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul)，100U | ￥880.00 | |
| C11055-1 | riboFECT mRNA Transfection Reagent, 75ul | ￥800.00 | |
| C11062-1 | riboFECT EGFP mRNA for Transfection Control,500ng/μL, 10ug | ￥1,200.00 | |
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