CCR7趨化因子受體刺激誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)向引流淋巴結(jié)快速而短暫的遷移，這對(duì)于啟動(dòng)保護(hù)性免疫和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，終止CCR7介導(dǎo)DC遷移的機(jī)制尚不完全清楚。近期，曹雪濤研究組和劉娟研究組在Immunity（IF21.522）期刊發(fā)表了題為CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1a-Mediated Glycolysis的研究成果。報(bào)道了一種長鏈非編碼RNA lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α介導(dǎo)的糖酵解來反饋抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移。證明了CCR7誘導(dǎo)的lnc-Dpf3在耦合表觀遺傳和代謝途徑，以反饋調(diào)控DC遷移和炎癥反應(yīng)方面的關(guān)鍵作用。進(jìn)一步揭示了炎癥免疫反應(yīng)后期及時(shí)終止DC遷移并減弱其免疫激活功能的分子機(jī)制。

主要研究路線

? ?lncRNA表達(dá)譜分析鑒定參與DC遷移的lncRNA分子（研究結(jié)果1）

? ?構(gòu)建lnc-Dpf3缺失小鼠模型進(jìn)行體內(nèi)外功能研究及表型鑒定（研究結(jié)果2-3）

? ?確定調(diào)控lnc-Dpf3表達(dá)的機(jī)制（研究結(jié)果4）

? ?確定lnc-Dpf3抑制DC遷移的分子機(jī)制（研究結(jié)果5-7）

主要研究結(jié)果

1、lnc-Dpf3抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移

之前的研究已將STAT3結(jié)合的lnc-DC鑒定為DC成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，lncRNAs在DC遷移中的功能仍然未知。有研究表明，呼吸道DCs從肺部向引流淋巴結(jié)(dLNs)快速而瞬時(shí)的遷移早在肺部病毒感染后6h就發(fā)生了，并在感染后18h迅速減緩；皮膚刺激也可在24h內(nèi)誘導(dǎo)類似的DC從皮膚向dLNs遷移的瞬時(shí)性增加。因此，研究人員猜想CCR7刺激可能會(huì)在DC向dLNs遷移的峰值（體內(nèi)感染或刺激后約18-24h）后誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)變化，從而起到反饋?zhàn)饔茫乐笵C過度積累。

為了驗(yàn)證猜想，研究人員制備了LPS刺激的骨髓源性DCs（成熟DCs，mDCs），然后在體外用或不用CCR7配體CCL19和CCL21刺激mDCs 12小時(shí)。通過lncRNA表達(dá)譜分析，在CCR7刺激的mDCs中共檢測到34個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs（18個(gè)上調(diào)，26個(gè)下調(diào)）。對(duì)18個(gè)上調(diào)的lncRNAs進(jìn)行qRT-PCR分析證實(shí)，其中6個(gè)在CCR7刺激后顯著上調(diào)。隨后，通過對(duì)這6個(gè)lncRNAs進(jìn)行RNAi介導(dǎo)的功能篩選，發(fā)現(xiàn)CCR7介導(dǎo)的mDC在體外的遷移可以通過沉默一個(gè)內(nèi)含子lncRNA而顯著增加，該內(nèi)含子lncRNA位于小鼠Dpf3基因的內(nèi)含子1內(nèi)，因此命名為lnc-Dpf3。

RACE實(shí)驗(yàn)確定了lnc-Dpf3序列有4076個(gè)核苷酸。并且像大多數(shù)lncRNAs一樣，lnc-Dpf3有5’帽子結(jié)構(gòu)和polyA尾，但沒有蛋白編碼能力。此外，證實(shí)了使用不同的silencers（該研究涉及的smart silencers由3條siRNA和3條ASO組成，可全方位高效抑制細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA或mRNA，均由銳博生物提供）沉默lnc-Dpf3可以有效地增加CCR7介導(dǎo)的mDC遷移。表明lnc-Dpf3在體外參與抑制DC遷移。

2、?DC特異性lnc-Dpf3缺失可選擇性促進(jìn)CCR7介導(dǎo)的DC遷移

為了進(jìn)一步探索lnc-Dpf3的生物學(xué)作用，研究人員通過同源重組產(chǎn)生了CD11c+DCs中l(wèi)nc-Dpf3特異性缺失的lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠。并且證實(shí)了DC特異性DCS-Dpf3缺失不影響主要免疫細(xì)胞亞群的分化，也不影響DC的成熟和T細(xì)胞刺激能力。

那么，lnc-Dpf3缺失是否會(huì)影響CCR7觸發(fā)的DC遷移呢？研究人員發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，CCR7刺激12h后，來自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的未成熟和成熟DCs的遷移增加。腺病毒介導(dǎo)的lnc-Dpf3過表達(dá)在12h后減少了CCR7觸發(fā)的DC遷移。但是在CCR7刺激后的早期階段lnc-Dpf3不影響DC的遷移。表明lnc-Dpf3在體外反饋抑制CCR7觸發(fā)的后期DC遷移中具有選擇性作用。

接下來，研究人員探索了lnc-Dpf3在體內(nèi)的功能。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照mDCs相比，lnc-Dpf3沉默的mDCs在注射后期（24-48h）顯示出向dLNs的遷移增加。同樣地，與注射后24-48h的mDCs相比，來自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的mDCs向dLNs的遷移也呈增加趨勢(shì)。用FITC涂抹皮膚后48 h，lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠dLNs中FITC+ DCs的比例增加。表明lnc-Dpf3在體內(nèi)抑制后期DC向dLNs的遷移。

3、?DC特異性lnc-Dpf3缺陷小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥

研究人員接下來探討了lnc-Dpf3在體內(nèi)控制DC依賴性炎癥反應(yīng)中的生理作用。以2,4-二硝基氟苯(DNFB)作為抗原的小鼠接觸性過敏(CHS)是一種成熟的人類接觸性皮炎模型，依賴于CCR7介導(dǎo)DC向dLNs的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究人員發(fā)現(xiàn)lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠在CHS誘導(dǎo)后出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為耳腫脹程度加重、組織損傷加重、炎癥浸潤加重。這些小鼠的炎癥被發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)大的Th1和Th17細(xì)胞群，并且與對(duì)照相比，DNBS體外再刺激后dLNs中干擾素(IFN)-g和白細(xì)胞介素(IL)-17的濃度更高。此外，注射lnc-dpf3（負(fù)載DNBS）沉默的mDCs的小鼠在接受DNFB刺激后比對(duì)照小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的CHS反應(yīng)。因此，lnc-Dpf3可減弱DCs的適應(yīng)性反應(yīng)和炎癥損傷。

由于穩(wěn)定條件下CCR7介導(dǎo)的DC向dLNs的遷移有助于外周耐受，lnc-Dpf3是否也參與了穩(wěn)態(tài)DC的遷移呢？研究發(fā)現(xiàn)lnc-Dpf3既不影響穩(wěn)態(tài)DC遷移，也不影響外周耐受的產(chǎn)生。并且在穩(wěn)態(tài)和炎性條件下，lnc-Dpf3在遷移DCs中均上調(diào)，但在炎癥條件下，又可選擇性減弱CCR7介導(dǎo)的DC遷移。

4、?CCR7刺激通過去除m6A修飾上調(diào)lnc-Dpf3的表達(dá)，以防止其降解

由于lnc-Dpf3的動(dòng)態(tài)表達(dá)與其調(diào)控功能模式密切相關(guān)，那么lnc-Dpf3是如何被CCR7刺激調(diào)控的呢。研究人員首先通過ChIP實(shí)驗(yàn)確定了CCR7刺激在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)lnc-Dpf3基因表達(dá)無影響，因此排除轉(zhuǎn)錄機(jī)制。接下來，研究了CCR7刺激是否影響lnc-Dpf3的亞細(xì)胞定位。FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lnc-Dpf3主要定位在胞質(zhì)中，少部分位于細(xì)胞核。但CCR7刺激沒有明顯影響lnc-Dpf3的亞細(xì)胞分布。

隨后，研究人員猜想CCR7刺激是否通過RNA穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控增加了lnc-Dpf3的表達(dá)。由于m6A廣泛影響RNA的代謝和穩(wěn)定性，那么lnc-Dpf3在DCs中的動(dòng)態(tài)表達(dá)是否受m6A相關(guān)調(diào)控呢？因此，研究人員通過MeRIP-qPCR在靜息mDCs中檢測到m6A顯著富集在lnc-Dpf3第22片段（3766-3903 nt）, 并且CCR7刺激顯著降低了m6A的峰值。RIP實(shí)驗(yàn)表明，lnc-Dpf3的m6A峰被m6A reader Ythdf2識(shí)別，CCR7刺激可下調(diào)Ythdf2對(duì)lnc-Dpf3的識(shí)別。而Ythdf1或Ythdf2本身的表達(dá)不受CCR7刺激的影響。此外，用siRNA沉默Ythdf2可上調(diào)lnc-Dpf3的表達(dá)。

接下來，研究人員對(duì)位于lnc-Dpf3第22片段3812-3815nt和3852-3855nt處的兩個(gè)m6A motifs進(jìn)行突變并構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，兩個(gè)m6A motifs突變的lnc-Dpf3過表達(dá)質(zhì)粒可導(dǎo)致lnc-Dpf3的生命周期延長。表明lnc-Dpf3這兩個(gè)m6A修飾有助于lnc-Dpf3 RNA的衰變。MeRIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了lnc-Dpf3在3812-3815 nt和3852-3855 nt處的m6A修飾在介導(dǎo)lnc-Dpf3 RNA降解中發(fā)揮協(xié)同作用。

表明lnc-Dpf3在3812-3815nt和3852-3855nt處具有m6A修飾，可被Ythdf2識(shí)別并靶向其降解。CCR7刺激通過介導(dǎo)m6A去甲基化和減輕lnc-Dpf3的m6A依賴性RNA降解來上調(diào)lnc-Dpf3表達(dá)。

5、CCR7-誘導(dǎo)型lnc-Dpf3通過靶向HIF-1a抑制DC遷移

研究人員通過一系列的排除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過PI3K、Akt和HIF-1α的信號(hào)傳導(dǎo)可能參與CCR7介導(dǎo)的DC遷移的功能。HIF-1α是細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激反應(yīng)的中心轉(zhuǎn)錄因子，在控制先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的各個(gè)方面發(fā)揮著重要作用。考慮到感染組織和淋巴結(jié)的低氧微環(huán)境，研究人員推測lnc-Dpf3可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α的激活來調(diào)控CCR7介導(dǎo)的DC遷移。并且發(fā)現(xiàn)DC特異性HIF-1α缺陷小鼠在體內(nèi)外都表現(xiàn)出DC遷移受損。因此，HIF-1α是CCR7介導(dǎo)的DC遷移所必需的。

值得注意的是，mDCs中l(wèi)nc-Dpf3的沉默或缺失增加了CCR7刺激誘導(dǎo)的HIF-1α的核轉(zhuǎn)位，而不影響細(xì)胞間總HIF-1α的豐度。RNA-seq分析證實(shí)，一系列HIF-1α靶向糖酵解基因（如Hk1，Ldha和Slc2a1）在lnc-Dpf3沉默的DCs中被上調(diào)。此外，EMSA和ChIP分析表明mDCs中l(wèi)nc-Dpf3的沉默或缺失可增加mDCs中Ldha基因啟動(dòng)子區(qū)HIF-1α的DNA結(jié)合活性和積累。表明lnc-Dpf3能夠減弱CCR7誘導(dǎo)的HIF-1α活性和糖酵解基因Ldha的表達(dá)。

然后，研究人員探索了lnc-Dpf3是否通過HIF-1α起作用。發(fā)現(xiàn)HIF-1α缺失可以阻斷l(xiāng)nc-Dpf3沉默或過表達(dá)在增加或減少DC遷移中的作用，通過siRNA沉默Hif1α可以抵消lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC遷移中的作用。表明lnc-Dpf3通過靶向HIF-1α抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移。

6、?lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α依賴性糖酵解來抑制DC遷移

為了弄清楚CCR7依賴性遷移的代謝基礎(chǔ)，研究人員通過mDCs的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在CCR7刺激后12小時(shí)，選擇性CCR7可誘導(dǎo)與葡萄糖代謝相關(guān)的代謝中間體(如葡萄糖1-磷酸、葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸)的積累。代謝途徑富集分析(MPEA)表明，CCR7刺激可誘導(dǎo)與糖酵解密切相關(guān)的關(guān)鍵代謝途徑的變化，如淀粉和蔗糖的代謝。此外，還發(fā)現(xiàn)CCR7刺激后DCs的胞外酸化（ECAR）快速且持續(xù)增加。并且作為代謝轉(zhuǎn)向有氧糖酵解指標(biāo)的ECAR/OCR（胞外酸化/耗氧量）比值在CCR7刺激12h后不斷增加，在lnc-Dpf3沉默的DCs中比值更高。

隨后，研究人員檢測到mDCs中的葡萄糖攝取、乳酸產(chǎn)量，NAD+/NADH比值增加，表明lnc-Dpf3的沉默或缺失可增加CCR7誘導(dǎo)的糖酵解；相反，過表達(dá)lnc-Dpf3或DC特異性HIF-1α缺失會(huì)抑制CCR7刺激mDCs中的乳酸產(chǎn)生。重要的是，用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）處理DCs可以在體內(nèi)外抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移，并消除lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC遷移中的作用。因此，lnc-Dpf3是通過抑制糖酵解負(fù)調(diào)控后期DC遷移。

以上數(shù)據(jù)表明CCR7刺激可誘導(dǎo)DCs中HIF-1α依賴性糖酵解反應(yīng)，并且lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α依賴性代謝重編程轉(zhuǎn)向有氧糖酵解來抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移。

7、lnc-Dpf3通過HRE motif直接抑制HIF-1α從而抑制DC糖酵解

由于Hif1α自身mRNA表達(dá)不受lnc-Dpf3的影響，研究人員推測lnc-Dpf3可能與HIF-1α物理相關(guān)并通過翻譯后機(jī)制調(diào)控其活性。隨后通過RIP實(shí)驗(yàn)、FISH實(shí)驗(yàn)和鄰位連接技術(shù)證實(shí)了lnc-Dpf3和HIF-1α之間的物理相互作用，并且CCR7刺激增加了這種相互作用。接下來，研究人員用缺氧反應(yīng)元件（HRE）驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因來檢測HEK293T細(xì)胞中的HIF-1α活性，HEK293T細(xì)胞是一種具有與mDCs類似的CCR7蛋白表達(dá)的細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)在常氧和缺氧條件下，CCR7刺激均以Akt依賴性方式增強(qiáng)HIF-1α活性。過表達(dá)lnc-Dpf3抑制了HIF-1α的活化。隨后RNA pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了全長lnc-Dpf3及其3000–4076 nt（F4）片段均可直接結(jié)合HIF-1α。

為了確定HIF-1α與lnc-Dpf3結(jié)合的區(qū)域，研究人員通過RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-1α的NT1（N-末端結(jié)構(gòu)域1，1-200 aa）和CT（C末端結(jié)構(gòu)域，600-826 aa）結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合lnc-Dpf3，其他結(jié)構(gòu)域則不行。此外，lnc-Dpf3主要在細(xì)胞質(zhì)中與HIF-1α和CT結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與HIF-1α的NT1結(jié)構(gòu)域的結(jié)合主要發(fā)生在細(xì)胞核中。

眾所周知，HIF-1α與靶基因啟動(dòng)子區(qū)稱為缺氧反應(yīng)元件(HREs)的核心核苷酸序列相結(jié)合。那么，HIF-1α是否可以與lncRNA上的HRE元件相互作用呢？研究人員發(fā)現(xiàn)在lnc-Dpf3 F4片段內(nèi)的3686-3690nt處含有一個(gè)HRE motif，且該HRE-motif突變可部分削弱F4片段抑制HIF-1α活性的能力，并可消除lnc-Dpf3與HIF-1α的結(jié)合。腺病毒介導(dǎo)的lnc-Dpf3過表達(dá)，而不是其△HRE突變，可抑制CCR7介導(dǎo)的DC遷移和乳酸生成，并且可以挽救lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠mDCs中過度的DC遷移和乳酸生成。

接下來，研究人員構(gòu)建了過表達(dá)WT HIF-1α慢病毒載體或在HIF-1α CT結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)保守氨基酸發(fā)生丙氨酸突變的慢病毒載體，分別為D810A的組成型失活突變和N814A組成型激活突變。發(fā)現(xiàn)與HIF-1α-WT相比，HIF-1α-N814A過表達(dá)可增強(qiáng)DC遷移，而過表達(dá)HIF-1α-D810A則抑制DC遷移。此外，HIF-1α-D810A過表達(dá)后可消除lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+ DCs中遷移的增加。因此，HIF-1α活化對(duì)于lnc-Dpf3缺失引起的DC遷移增強(qiáng)至關(guān)重要。

總之，這些數(shù)據(jù)表明lnc-Dpf3通過其3000-4076nt結(jié)構(gòu)域中的HRE motif與HIF-1α的N和C末端相互作用，并且該motif對(duì)于lnc-Dpf3抑制HIF-1α的活性和調(diào)節(jié)CCR7介導(dǎo)的DC遷移均具有重要作用。

原文：Liu J, Zhang X, Chen K, et al. CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1α-Mediated Glycolysis[J]. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.