1） 摘要

環(huán)狀RNAs（circRNAs）代表一類廣泛而多樣的內(nèi)源性RNAs，可調(diào)控真核生物中的基因表達(dá)。然而，人類circRNAs的調(diào)節(jié)和功能仍然大部分未知。本研究從六個(gè)正常組織和七種癌癥的去核糖體RNA測(cè)序中檢測(cè)到至少27000個(gè)候選的circRNAs。許多這些circRNAs在正常和癌組織之間差異表達(dá)。作者進(jìn)一步表征了來自HIPK3基因的外顯子2的一個(gè)豐富的circRNA，稱為circHIPK3。circHIPK3沉默（而不是HIPK3 mRNA）顯著抑制人類細(xì)胞生長。通過熒光素酶篩選試驗(yàn)，觀察到circHIPK3具有18個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)作為9個(gè)miRNAs海綿。具體而言，研究顯示circHIPK3直接結(jié)合miR-124并抑制miR-124活性。研究結(jié)果提供證據(jù)表明從前體mRNA產(chǎn)生的環(huán)狀RNA可能在人類細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)作用。

2） 研究背景

來自反向剪接外顯子的環(huán)狀RNAs（circRNAs）最近被鑒定為天然存在的非編碼RNA家族，其在真核轉(zhuǎn)錄組中高度存在。已經(jīng)在各種細(xì)胞系和不同物種中成功鑒定了大量的circRNAs。最近，已經(jīng)證明circRNA作為microRNA（miRNA）海綿來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。具體而言，含有70多個(gè)常規(guī)miR-7結(jié)合位點(diǎn)的circRNA ciRS-7（也稱為CDR1as）已經(jīng)被鑒定為miRNA抑制劑。然而，只有少數(shù)這樣的circRNA包含多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)來捕獲一個(gè)特定的miRNA，并且circRNA的功能仍然大部分是未知的。

3） 研究路線

1、 circHIPK3篩選及鑒定：circRNA高通量測(cè)序、生物信息分析、qRT-PCR、Northern blot 、RNA FISH等
2、 circHIPK3生物合成機(jī)制鑒定：表達(dá)載體(含有不同側(cè)翼的Alu序列的截短體)、CRISPR/Cas9
3、 circHIPK3功能研究：qRT–PCR、RNAi、CCK-8檢測(cè)、EdU等
4、 機(jī)制研究：RIP、熒光素酶報(bào)告基因、miRNA mimics、ClIP、qRT–PCR、RNA熒光原位雜交

4） 研究結(jié)果

circHIPK3篩選及驗(yàn)證

作者通過去核糖體RNA高通量測(cè)序共鑒定出27296個(gè)環(huán)狀RNA分子，circRNA在不同組織中的表達(dá)模式非常特異（圖1a）。生物信息分析顯示單個(gè)蛋白基因可以產(chǎn)生多個(gè)circRNAs，但同一基因起源的circRNA也存在優(yōu)勢(shì)表達(dá)的circRNA。CircHIPK3由HIPK3基因的2號(hào)外顯子形成，相比于HIPK3基因產(chǎn)生的其他circRNAs分子表達(dá)豐度最高，qPCR檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果證實(shí)circHIPK3的存在（圖1b）。FISH顯示circHIPK3主要存在細(xì)胞質(zhì)（圖1c）。

circHIPK3功能研究

作者通過將2號(hào)外顯子和側(cè)翼Alu序列分段構(gòu)建表達(dá)載體以及采用CRISPR/Cas9技術(shù)，發(fā)現(xiàn)circHIPK3成環(huán)表達(dá)需要兩翼Alu序列協(xié)助，不可或缺（圖2a,2b）。使用siRNA敲降circHIPK3后發(fā)現(xiàn)顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力，EdU實(shí)驗(yàn)得到同樣的結(jié)論（圖2c,2d）。而敲降線性HIPK3則無作用。

機(jī)制研究

作者借助公共數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在circHIPK3基因組位置存在許多AGO2結(jié)合位點(diǎn)，暗示miRNA可能結(jié)合circHIPK3，進(jìn)一步預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circHIPK3序列存在多種miRNA結(jié)合位點(diǎn)。通過miRNA靶基因熒光素酶報(bào)告基因篩選系統(tǒng)，鑒定9個(gè)miRNA對(duì)熒光素酶活性有顯著抑制效果（圖3a）。其中miR-124的抑制效果最為明顯（圖3b）。共定位實(shí)驗(yàn)表明，circHIPK3與miR-124相互結(jié)合（圖3c）。異位表達(dá)的circHIPK3能緩解miR-124抑制增殖的作用。在人的6個(gè)正常組織中檢測(cè)circHIPK3和miR-124的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在腦中表達(dá)最高，表達(dá)譜模式正相關(guān)，進(jìn)一步表明circHIPK3和miR-124結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞生長（圖3d）。

5） 結(jié)論

1、 鑒定出人類六種正常組織和七種腫瘤組織中近三萬種環(huán)狀RNA及特征；
2、 鑒定高表達(dá)的外顯子樣環(huán)狀RNA circHIPK3；
3、 含有多個(gè)重復(fù)序列的長內(nèi)含子對(duì)circHIPK3生物合成具有重要作用 ；
4、 環(huán)狀RNA circHIPK3與包括miR-124的9種miRNA結(jié)合起調(diào)控作用。

本研究中所用siRNA、EdU、miRNA mimics均由銳博生物提供。

原文：Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature communications, 2016, 7.