環(huán)狀RNAs（circRNAs）由一大類無5’末端帽和3’末端poly（A）尾的非編碼RNAs組成，它們是由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，通過反向剪接形成共價(jià)閉合的RNA環(huán)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是無rRNA測(cè)序分析的應(yīng)用，在真核生物中發(fā)現(xiàn)了大量的circRNAs。circRNA剪接過程受到多種因素的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄延伸率、多個(gè)順式或反式調(diào)控位點(diǎn)、剪接復(fù)合物和順式或反式作用元件。最近的研究表明，這些新型circRNAs在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，如細(xì)胞增殖、粘附、凋亡和存活。此外，在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝綜合征和腫瘤進(jìn)展中也發(fā)現(xiàn)了一些與疾病相關(guān)的circRNAs，它們的功能可作為競(jìng)爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）充當(dāng)特定microRNAs海綿、結(jié)合蛋白、調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄和剪接，甚至通過翻譯產(chǎn)生多肽。
迄今為止，circRNAs在癌癥研究領(lǐng)域已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。盡管越來越多的研究報(bào)道了乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌中的異常circRNAs，但circRNAs在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能、分子機(jī)制和環(huán)化模式仍不清楚。有趣的是，circRNAs可以通過病理功能未知的外泌體從癌細(xì)胞分泌到循環(huán)中。外泌體是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的30-150nm的細(xì)胞外囊泡，其裝載物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。迄今為止，已有報(bào)道稱，內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體（ESCRT）依賴性和ESCRT非依賴性途徑可以調(diào)節(jié)外泌體對(duì)裝載物進(jìn)行分選。然而，ESCRT-II復(fù)合體可能參與了核酸的外泌體分選過程，miRNAs的特定序列可以決定裝載物是否被分選到外泌體中。與線性RNAs相比，circRNAs更容易分選進(jìn)入外泌體，但circRNAs的外泌體特異性分選機(jī)制仍然完全未知。
circRHOBTB3是通過宿主基因RHOBTB3的剪接和環(huán)化產(chǎn)生的。作為Rho GTPase家族的ATPase，宿主基因RHOBTB3參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白酶體降解，可通過促進(jìn)腎癌中HIF-α的蛋白酶體降解來抑制腫瘤生長。先前的研究還表明circRHOBTB3在卵巢癌、胃癌、CRC和肝細(xì)胞癌（HCC）中是一種腫瘤抑制性circRNA。然而，其環(huán)化模式和外泌體分泌途徑尚不明確。
反義寡核苷酸（ASO）是8-50 nt的單鏈寡（脫氧）核苷酸或（脫氧）核苷酸類似物，可以人工合成，具有多種化學(xué)修飾（例如硫代磷酸酯）。ASOs可以調(diào)節(jié)RNA的生物合成、蛋白質(zhì)翻譯、可變剪接以及RNA結(jié)合蛋白（RBPs）與RNA的相互作用。隨著技術(shù)的進(jìn)步，這些修飾的ASOs已被應(yīng)用于治療一些疾病，如巨細(xì)胞病毒（CMV）引起的脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）、純合子家族性高膽固醇血癥（HoFH）、急性肝卟啉癥（AHP）和脊髓性肌萎縮癥（SMA）。
近日，Molecular Cancer（IF27.401）期刊發(fā)表了題為Tumor-suppressive circRHOBTB3 is excreted out of cells via exosome to sustain colorectal cancer cell fitness的研究論文。闡明了circRHOBTB3在CRC中的抑制作用，提出了一種新的“外泌體逃逸”假說，即腫瘤細(xì)胞必須分泌抑制性circRNAs才能維持癌細(xì)胞的適應(yīng)性。此外，還研究了靶向circRHOBTB3環(huán)化和外泌體分選元件的特異性ASOs在CRC中的潛在治療效果，這可能成為一種新穎且有前景的抗腫瘤治療靶向策略。
首先，研究人員對(duì)公共數(shù)據(jù)庫中多種癌癥患者（12例CRC患者、21例HCC患者、32例PAAD患者）血清外泌體中的circRNA水平進(jìn)行了全面分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清外泌體中存在多種circRNAs差異表達(dá)，其中只有circRNA hsa_circ_0007444在所有三種癌癥來源的外泌體中上調(diào)，由于hsa_circ_0007444是由RHOBTB3的第6和第7外顯子組成，因此將其命名為circRHOBTB3。隨后，研究人員檢測(cè)了18例CRC患者和16例健康對(duì)照血清中circRHOBTB3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CRC患者血清中circRHOBTB3水平高于健康對(duì)照，而其在CRC組織中顯著下調(diào)，且下調(diào)與預(yù)后不良有關(guān)。
Fig1. CRC中circRHOBTB3的鑒定和表征
接著，研究人員在體外和體內(nèi)研究了circRHOBTB3在CRC中的功能。體外實(shí)驗(yàn)顯示circRHOBTB3作為一種腫瘤抑制性circRNA發(fā)揮作用，敲低circRHOBTB3可促進(jìn)SW480細(xì)胞的遷移和侵襲；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示circRHOBTB3抑制了CRC的生長和轉(zhuǎn)移。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3被包裹到外泌體中并分泌進(jìn)入循環(huán)中，最終通過泌尿系統(tǒng)排出體外。因此，研究人員推測(cè)CRC細(xì)胞必須通過外泌體分泌腫瘤抑制性circRHOBTB3來維持癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的特征。
Fig2. circRHOBTB3在腫瘤細(xì)胞外分泌，在體內(nèi)外抑制CRC細(xì)胞
隨后，為了確定circRHOBTB3的下游信號(hào)和結(jié)合蛋白，研究人員通過RNA-seq、RNA pull-down并結(jié)合質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)circRHOBTB3通過抑制CRC中的代謝途徑和細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生來發(fā)揮腫瘤抑制性circRNA的作用，并且還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)調(diào)節(jié)circRHOBTB3環(huán)化和外泌體分泌的關(guān)鍵元件。此外，研究人員鑒定出SNF8可以將circRHOBTB3分選進(jìn)入外泌體。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞可以比正常細(xì)胞主動(dòng)分泌更多的circRHOBTB3。
Fig3. circRHOBTB3根據(jù)其特定的基序序列被分選到外泌體中
之前的研究將circRHOBTB3鑒定為由外泌體分泌到細(xì)胞外的腫瘤抑制性circRNA。研究人員想確定通過增加circRHOBTB3環(huán)化和減少分泌是否可以成為一種治療策略。因此，反義寡核苷酸（ASOs）被設(shè)計(jì)用于靶向circRHOBTB3的環(huán)化和分泌元件用于CRC治療。根據(jù)環(huán)化和外泌體分泌的調(diào)控元件序列，研究人員設(shè)計(jì)并合成了ASOs，結(jié)果顯示ASOs增加了circRHOBTB3的表達(dá)，阻斷了circRHOBTB3的外泌體分泌。更重要的是，ASOs可以在體內(nèi)抑制CRC的生長和轉(zhuǎn)移。
Fig4. ASO在體內(nèi)抑制CRC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移
總之，本研究結(jié)果表明了circRHOBTB3在CRC中發(fā)揮腫瘤抑制作用，必須從細(xì)胞中排出以維持癌細(xì)胞的適應(yīng)性。ASOs靶向環(huán)化和外泌體分泌的調(diào)節(jié)元件將成為一種新的抗腫瘤策略。
原文鏈接：https://link.springer.com/article/10.1186/s12943-022-01511-1
本研究使用到的動(dòng)物用ASO、T7生物素體外轉(zhuǎn)錄試劑盒均由銳博生物提供！
