研究背景

LncRNAs已經(jīng)成為不同生物過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，并且可以通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。重要的是，組織特異性lncRNA表達(dá)模式賦予了lncRNA在胚胎干細(xì)胞（ESC）的譜系特異性分化過(guò)程中具有潛在的關(guān)鍵作用。最近，lncRNA已被證明參與細(xì)胞命運(yùn)決定，特別是心臟譜系特化。但對(duì)lncRNAs在心臟譜系中作用的了解仍然有限。

心臟發(fā)育是一個(gè)多步驟的過(guò)程，取決于對(duì)網(wǎng)絡(luò)的精確控制，包括多種心臟特異性轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾因子和信號(hào)通路。T-box轉(zhuǎn)錄因子Eomes缺失顯著損害中內(nèi)胚層分化，包括心臟中胚層特化。然而，Eomes如何參與特定的心肌分化尚不清楚。先前的研究表明Eomes通過(guò)直接結(jié)合Mesp1基因的啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)Mesp1表達(dá)。但是Eomes在心臟中胚層特化期間誘導(dǎo)Mesp1表達(dá)的精確調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。

● ?Linc1405敲降抑制小鼠ESCs的心肌分化
● ?Linc140的第2外顯子與Eomes結(jié)合驅(qū)動(dòng)心臟譜系定型
● ?Linc1405在Mesp1增強(qiáng)子上調(diào)節(jié)Eomes/WDR5/GCN5復(fù)合物
● ?Linc1405缺失阻礙心臟發(fā)育和體內(nèi)功能

主要研究結(jié)果

本研究鑒定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄于中胚層Eomes基因鄰近區(qū)域的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc1405，F(xiàn)ISH分析顯示其在胚胎心臟中高表達(dá)(LncRNA FISH probe及全系列試劑盒由銳博生物提供)。功能缺失性/獲得性實(shí)驗(yàn)顯示linc1405缺失顯著抑制了ESC的心肌分化，包括心肌標(biāo)志物表達(dá)減少以及自發(fā)搏動(dòng)的EBs和cTnT+ CMs的百分比降低。linc1405過(guò)表達(dá)則得到相反的結(jié)果，且在EB和CM分化中，通過(guò)linc1405過(guò)表達(dá)可顯著挽救linc1405缺失導(dǎo)致的心肌標(biāo)志物mRNA水平和cTnT+細(xì)胞比例的降低。

通過(guò)微陣列分析顯示，linc1405敲降MES細(xì)胞中鑒定了65個(gè)上調(diào)基因和124個(gè)下調(diào)基因。下調(diào)的基因主要分為轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合蛋白，主要與多細(xì)胞組織發(fā)育和細(xì)胞分化有關(guān)。DEG分析顯示，在linc1405敲降CM細(xì)胞中鑒定了189個(gè)上調(diào)基因和261個(gè)下調(diào)基因。主要與特化模式、肌肉組織發(fā)育和心臟發(fā)育有關(guān)。并且DEGs與不同的心肌疾病密切相關(guān)。表明linc1405在調(diào)節(jié)心肌分化的核心網(wǎng)絡(luò)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

通過(guò)染色質(zhì)和RNA免疫沉淀試驗(yàn)表明，linc1405介導(dǎo)了組蛋白甲基化修飾復(fù)合物TrxG組分WDR5和組蛋白乙酰化酶GCN5形成新型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物結(jié)合到Eomes下游Mesp1基因的增強(qiáng)子區(qū)，引起Mesp1基因增強(qiáng)子區(qū)域表觀修飾環(huán)境（包括組蛋白甲基化和乙酰化水平）的改變，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物在Mesp1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的組裝，并在胚胎干細(xì)胞的心臟中胚層特化期間激活Mesp1的表達(dá)。

此外，免疫共沉淀及熒光素酶報(bào)告基因顯示linc1405的第2個(gè)外顯子是其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Eomes和組蛋白修飾分子相互作用，并識(shí)別Mesp1基因增強(qiáng)子區(qū)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Mesp1表達(dá)和心肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵功能片段。

重要的是，F(xiàn)ISH分析顯示linc1405在E7.5胚胎的原條區(qū)域中表達(dá)，WDR5和GCN5在原條區(qū)域中與Eomes共表達(dá)(LncRNA FISH probe及全系列試劑盒由銳博生物提供)。這些結(jié)果表明linc1405和Eomes、WDR5和GCN5在原條區(qū)域共定位。通過(guò)構(gòu)建linc1405敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，敲除小鼠的室間隔（IVS）和左心室壁（LVW）的厚度更薄；此外，敲除小鼠的心臟射血分?jǐn)?shù)百分比（EF％）、左室短軸縮短率（FS％）和心肌厚度（IVS和左心室后壁[LVPW]）顯著降低，表明linc1405缺失導(dǎo)致心臟發(fā)育和功能受損。

因此，提出了研究人員提出了一種整合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模型，其中l(wèi)inc1405通過(guò)聯(lián)合WDR5和GCN5（對(duì)于心臟發(fā)生至關(guān)重要）介導(dǎo)Eomes在原條區(qū)域中激活Mesp1表達(dá)的不同作用。總之，linc1405介導(dǎo)的Eomes/WDR5/GCN5復(fù)合物有助于心臟發(fā)生，強(qiáng)調(diào)了基于lincRNA的復(fù)合物在體外和體內(nèi)心臟發(fā)生的表觀遺傳調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用。

本研究中FISH實(shí)驗(yàn)使用的Fluorescent In Situ Hybridization Kit，lncRNA FISH probes，Mouse U6 FISH probes，Mouse 18S FISH probes等均有銳博生物提供。