冰凍組織切片樣品制備方法
組織采集后，經(jīng)固定、冷凍、切片、晾片，方可進(jìn)行免疫抗體標(biāo)記。
1、組織的采集、固定和保存：
不同來源的組織可依據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩紤]采用不同的固定和保存方法。此處介紹幾種實(shí)驗(yàn)室常用方法。
1)液氮冷凍法：
采取新鮮組織后，即可放入液氮中，并保存于液氮中。
2)固定法：
采取新鮮組織后，4%多聚甲醛(4%PFA)4°C 固定1小時(shí)(根據(jù)組織大小和致密程度調(diào)整固定時(shí)間)或過夜，PBS緩沖液洗三次，每次10-30min，20%蔗糖中浸泡1小時(shí)或過夜，4°C保存于20%蔗糖(含0.05%NaN3)中。
2、組織的冷凍和切片：
組織的冷凍方法可根據(jù)固定和保存條件不同而不同。使用冷凍切片機(jī)，將組織冰切成4-20μm的切片，粘貼于處理過的載玻片上，室溫干燥1小時(shí)后，可進(jìn)行免疫標(biāo)記。或放入載片盒，-80°C密閉保存。
1)氣體CO2冷凍法：
將樣品置于樣品臺的OCT中，打開鋼瓶開關(guān)，CO2氣體噴出，迅速冷凍組織樣品。
2)干冰冷凍法：(適合小塊和致密度低的組織，如胚胎、小塊組織、活檢組織等)
將小組織塊放入冷凍包埋模具中，調(diào)整切面位置(必要時(shí)可在體視鏡下操作)后，置于干冰上(暫時(shí)無干冰，可置于-80°C)，待冷凍完全后，-80°C密閉保存。
3)直接冷凍法：
將樣品直接粘著在涂有OCT的樣品臺上，于冰切機(jī)(箱體溫度-80°C)中直接冷凍。
3、冰凍組織切片的化學(xué)熒光標(biāo)記：
將冰凍組織切片從-80°C 冰箱中取出，室溫放置10min, 待切片回溫并干燥，PBS 10min洗去OCT，可無需Triton處理，即可進(jìn)行化學(xué)熒光標(biāo)記，操作步驟請參見試劑盒使用方法。
4、冰凍組織切片的免疫熒光標(biāo)記：
將冰凍組織切片從-80°C 冰箱中取出，室溫放置10min, 待切片回溫并干燥，PBS 10min洗去OCT，可無需Triton處理，即可進(jìn)行免疫抗體標(biāo)記，操作步驟請參見免疫標(biāo)記方法。
5、冰凍組織切片的免疫酶反應(yīng)：(酶聯(lián)免疫反應(yīng)，在抗體作用之前或顯色時(shí)組織樣品需進(jìn)行內(nèi)源性酶抑制作用，以降低反應(yīng)背景)
1)堿性磷酸酶（AP）：
密封保存的組織切片
PBS? 5min
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V
含0.5%NS,1%BSA的PBS中室溫封閉30min-1hr
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V
一抗（稀釋過）??室溫1-1.5hr或4°C?過夜
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V
PBS? 10min??X?3
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V
二抗-AP（稀釋過）??室溫1.5-2hr
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V
PBS? 10min??X?3
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V
顯色:? AP-CDS? 5min?X?2
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V
NBT4.5ml/ml、BCIP3.5ml/ml in AP-CDS??室溫或37°C 5-30min
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V
TE??室溫?10min
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V
梯度乙醇脫水
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V
二甲苯透明
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V
中性樹膠封片
2)辣根過氧化物酶（HRP）：
密封保存的組織切片
PBS? 5min
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V
3%H2O2.10% MeOH in PBS??室溫3min
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V
PBS? 5min?X?3
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V
含0.5%NS,1%BSA的PBS中室溫封閉30min-1hr
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V
一抗（稀釋過）??室溫1-1.5hr或4°C?過夜
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V
PBS? 10min??X?3
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V
二抗-HRP（稀釋過）??室溫1.5-2hr
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V
PBS? 10min X?3
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V
顯色:? HRP-CDS室溫20-30min
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V
梯度乙醇脫水
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V
二甲苯透明
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V
中性樹膠封片
