了解非編碼RNAs（ncRNAs）在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用，將為鑒定診斷和治療靶點建立新的途徑。2019年5月17日，四川大學華西醫(yī)院吳泓、曾勇組在Cancer Research期刊上發(fā)表了題為LncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop的研究成果。該研究鑒定出lncRNA SNHG10及其同源snoRNA SCARNA13作為HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移的新驅(qū)動因子。揭示了LncRNA SNHG10通過正反饋環(huán)調(diào)節(jié)其同源物SCARNA13促進肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制。

研究背景

肝細胞癌（HCC）是中國第四大常見惡性腫瘤和第三大癌癥死因。然而HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制尚未完全闡明，因此鑒定關(guān)鍵的促癌分子將有助于理解HCC發(fā)病機制和鑒定潛在的治療靶點。近年來，lncRNAs和小RNAs之間的復雜相互作用被揭示，其中一些lncRNAs可以產(chǎn)生或調(diào)節(jié)小RNAs。SNHGs（小核仁RNA宿主基因）的初級RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子在細胞核內(nèi)可被加工成snoRNAs，而外顯子被剪接成lncRNAs并轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，表明snoRNAs與SNHGs轉(zhuǎn)錄的同源lncRNAs之間可能存在潛在的相關(guān)性。然而，這些lncRNAs和同源snoRNAs之間的特定關(guān)系以及它們在腫瘤發(fā)生中的特定作用卻知之甚少。

研究結(jié)果

1.?SNHG10和SCARNA13在肺轉(zhuǎn)移灶和HCC組織中高表達，與HCC患者預后不良有關(guān)?

為了鑒定參與HCC轉(zhuǎn)移的ncRNA，研究人員利用RNA-seq比較異種移植的HCC細胞和親本HCC細胞之間的表達譜，并進一步通過TCGA LIHC數(shù)據(jù)庫分析以及交叉分析鑒定出24個lncRNAs和6個snoRNAs可能在HCC的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。其中SNHG10和SCARNA13是來自相同初級RNA轉(zhuǎn)錄本的不同產(chǎn)物。更具體地，SCARNA13是由SNHG10基因的初級RNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子加工而成，而外顯子被剪接到SNHG10轉(zhuǎn)錄本中，表明SNHG10和SCARNA13可能協(xié)同促進HCC的發(fā)生和進展。因此，重點專注于lncRNA SNHG10及其同源物SCARNA13。

隨后，研究人員通過對TCGA LIHC數(shù)據(jù)庫分析以及對臨床64對HCC組織及其相鄰正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達水平進行了檢測。發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，HCC組織中SNHG10和SCARNA13的水平均升高，并且它們之間存在統(tǒng)計學上的正相關(guān)。此外，Kaplan-Meier分析顯示SNHG10或SCARNA13的高表達與總體生存率較差顯著相關(guān)。

接著，在HCC細胞系中過表達或敲低SNHG10會導致SCARNA13的表達顯著的增加或減少，而SCARNA13的缺失不影響SNHG10的表達。表明SNHG10可能是SCARNA13的上游調(diào)控因子。

2.?SNHG10和SCARNA13促進HCC細胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移?

為了闡明SNHG10在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的致癌作用，研究人員檢測了SNHG10對細胞表型的影響。發(fā)現(xiàn)SNHG10的缺失顯著抑制HCC細胞周期和增殖，并誘導細胞凋亡。此外，SNHG10的沉默大大減弱了HCC細胞的侵襲和遷移能力。

進一步的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，SNHG10缺失組中腫瘤的體積和重量顯著降低，表明SNHG10在體內(nèi)可增強HCC細胞的致瘤性。此外，研究人員評估了SNHG10對HCC細胞轉(zhuǎn)移的促進作用。通過肝/肺轉(zhuǎn)移檢測發(fā)現(xiàn)LV-shSNHG10組小鼠的肝/肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的熒光素酶信號強度顯著下降，表明SNHG10增強了HCC細胞的肝/肺轉(zhuǎn)移潛能。HE染色顯示LV-shSNHG10組的轉(zhuǎn)移灶在肺和肝組織切片中顯著降低。而過表達SNHG10則得到相反的結(jié)果。表明SNHG10在HCC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起致癌驅(qū)動因子的作用。

由于SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時上調(diào)。同樣地，研究人員發(fā)現(xiàn)與SNHG10相似，SCARNA13的敲低極大地抑制了細胞周期和增殖，并誘導了HCC細胞的凋亡。此外，SCARNA13的下調(diào)顯著損害了HCC細胞的侵襲和遷移能力。這些結(jié)果將SCARNA13鑒定為HCC中的致癌啟動子。

3.?轉(zhuǎn)錄因子c-Myb上調(diào)SNHG10和SCARNA13水平?

為了確定SNHG10和SCARNA13在HCC中表達升高的潛在機制，研究人員通過數(shù)據(jù)庫鑒定了9個可能與SNHG10基因啟動子區(qū)域結(jié)合的TFs。隨后，TCGA LIHC數(shù)據(jù)集的分析表明，在9個TFs中，c-Myb表達與SNHG10和SCARNA13表達的相關(guān)性最高。因此，推斷c-Myb可能導致SNHG10和SCARNA13表達升高。正如預期一樣，敲低c-Myb可顯著降低HCC細胞中SNHG10和SCARNA13的表達，表明c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上游調(diào)節(jié)因子。

接著，生物信息學分析預測了SNHG10啟動子區(qū)域有5個c-Myb結(jié)合位點（MBS）。隨后的ChIP實驗證實了c-Myb顯著富集在SNHG10啟動子區(qū)域中的MBS1和MBS3上。為了進一步確定SNHG10基因啟動子上c-Myb的轉(zhuǎn)錄激活，用SNHG10啟動子熒光素酶報告基因和c-Myb siRNA共轉(zhuǎn)染細胞。發(fā)現(xiàn)c-Myb的缺失顯著降低了SNHG10啟動子活性。這些數(shù)據(jù)表明c-Myb可以直接結(jié)合SNHG10的啟動子區(qū)域，導致HCC細胞中SNHG10和SCARNA13的上調(diào)。

4.?SNHG10作為miR-150-5p海綿可增加c-Myb表達?

從理論上來看，snoRNAs和同源lncRNAs分別位于細胞核和細胞質(zhì)中。FISH實驗（FISH探針/試劑盒由銳博生物提供）也證實了SNHG10主要定位于細胞質(zhì)中，而SCARNA13優(yōu)先位于細胞核中。接下來，研究人員探索了SNHG10調(diào)節(jié)SCARNA13表達的具體機制。生物信息學分析表明miR-150-5p可以結(jié)合SNHG10的309-315nt位點。RIP實驗顯示miR-150-5p和SNHG10在Ago2免疫沉淀物中均顯著富集，表明SNHG10存在于基于Ago2的miRNA誘導的抑制復合物中，并與miR-150-5p相關(guān)。

隨后，針對SNHG10設(shè)計10個ChIRP探針（ChIRP探針設(shè)計合成由銳博生物提供），通過ChIRP實驗以確定SNHG10和miR-150-5p之間的直接相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-150-5p強烈富集在SNHG10上。此外，miR-150-5p mimic顯著抑制了pmirGLO-SNHG10的熒光素酶活性，而突變型則無影響，證實了SNHG10對miR-150-5p具有海綿作用。

大量研究表明c-Myb是miR-150-5p的直接靶點，miR-150-5p過表達可使c-Myb mRNA和蛋白水平下調(diào)。而之前的研究證明c-Myb可以直接上調(diào)SNHG10的表達。基于SNHG10對miR-150-5p的海綿作用，研究人員推斷SNHG10介導的miR-150-5p的螯合可能對c-Myb的上調(diào)至關(guān)重要。進一步實驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)SNHG10后，c-Myb的表達增加，而miR-150-5p mimics完全消除了這一效應。相反，SNHG10敲低后，c-Myb的表達下降并被miR-150-5p海綿徹底挽救。

這些研究結(jié)果表明，SNHG10作為miR-150-5p的海綿，可以降低其對c-Myb的抑制作用，進而增強c-Myb的表達。此外，SNHG10和c-Myb可能形成正反饋環(huán)以維持HCC中SNHG10的高表達。

5.?SNHG10通過miR-150-5p/RPL4-c-Myb正反饋環(huán)調(diào)節(jié)SCARNA13的表達?

為了闡明c-Myb是否在SNHG10對SCARNA13的調(diào)節(jié)作用中不可或缺，研究人員進行了挽救實驗。發(fā)現(xiàn)與對照相比，LV-SNHG10細胞中SCARNA13的表達顯著升高，當轉(zhuǎn)染c-Myb siRNA后，SCARNA13的表達仍高于對照，暗示SNHG10可能不僅僅通過調(diào)節(jié)c-Myb的表達來調(diào)節(jié)SCARNA13。miR-150-5p inhibitor可使LV-Control細胞中SCARNA13的表達顯著升高，當共轉(zhuǎn)染miR-150-5p inhibitor和c-Myb siRNA后， SCARNA13的表達無明顯變化，證實了c-Myb完全介導了miR-150-5p對SCARNA13表達的調(diào)控作用。因此，可以看出c-Myb的表達水平是SNHG10過表達導致SCARNA13上調(diào)的部分原因。

接下來，為了評估RPL4對HCC細胞中c-Myb功能活性的正調(diào)節(jié)作用，構(gòu)建了含有c-Myb識別元件（MREs）的熒光素酶報告基因，發(fā)現(xiàn)RPL4可以增強MREs的活性。此外，Co-IP測定確定了RPL4與c-Myb之間的相互作用。最后，進一步的挽救實驗證明，轉(zhuǎn)染c-Myb siRNA和RPL4 siRNA后，LV-SNHG10細胞中SCARNA13的表達沒有發(fā)生統(tǒng)計學變化。

研究結(jié)果表明SNHG10一方面通過吸附miR-150-5p，另一方面通過與RPL4相互作用增強c-Myb的轉(zhuǎn)錄活性來促進c-Myb的表達，從而調(diào)節(jié)SCARNA13的表達。

6.?SCARNA13通過調(diào)節(jié)SOX9介導SNHG10驅(qū)動HCC細胞增殖、侵襲和遷移?

基于SNHG10和SCARNA13協(xié)同促進HCC細胞的惡性表型和SNHG10調(diào)節(jié)SCARNA13的表達，可以推斷出SNHG10對HCC細胞的腫瘤促進作用可能是由SCARNA13介導的。因此，SCARNA13 ASO轉(zhuǎn)染LVSNHG10細胞顯著挽救了SNHG10過表達對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。這些結(jié)果表明，SCARNA13介導了SNHG10的腫瘤促進功能。

詳情請查閱原文：

Lan T, Yuan K, Yan X, et al. LncRNA SNHG10 facilitates hepatocarcinogenesis and metastasis by modulating its homolog SCARNA13 via a positive feedback loop[J]. Cancer research, 2019: canres. 4044.2018.