許多信號級聯(lián)和分子（如神經(jīng)炎癥反應(yīng)、嘌呤受體、內(nèi)源性阿片肽和神經(jīng)營養(yǎng)因子）參與神經(jīng)性疼痛的發(fā)展。然而，神經(jīng)性疼痛的分子機制尚不清楚。環(huán)狀RNAs（circRNAs）是內(nèi)源性非編碼RNA，形成共價閉環(huán)；它們的序列在物種間是保守的，比線性mRNAs具有更高的穩(wěn)定性。大多數(shù)circRNAs在哺乳動物大腦中的表達豐度高于其他組織，這表明它們可能在病理過程中發(fā)揮重要作用，并可能作為某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物標志物。CircRNAs已被證明可作為競爭性內(nèi)源RNAs，通過堿基互補配對使miRNAs結(jié)合并調(diào)節(jié)靶mRNAs的翻譯。此外，有證據(jù)表明某些circRNAs可與RNA結(jié)合蛋白形成RNA-蛋白復(fù)合物并調(diào)節(jié)其活性。雖然最近的研究表明，神經(jīng)損傷改變了大鼠脊髓背角circRNA的表達，但circRNA是否以及如何引起神經(jīng)性疼痛尚未見報道。

2019年9月11日，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院信文君課題組在Nature Communications期刊上發(fā)表了題為CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain最新成果。首次發(fā)現(xiàn)脊髓特異性環(huán)狀RNA circAnks1a促進轉(zhuǎn)錄因子YBX1的核轉(zhuǎn)位，揭示了circAnks1a在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控背角神經(jīng)元VEGFB表達，并參與神經(jīng)損傷引起的中樞敏化和疼痛行為的分子機制，為開發(fā)有效治療神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)性疼痛提供了新的靶點。

1、脊髓背角circAnks1a的篩選與鑒定

首先，研究人員收集了脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）前后大鼠的脊髓背角組織并通過RNA-seq（由銳博生物提供）檢測其circRNA的表達。發(fā)現(xiàn)65.02％的circRNAs由編碼蛋白質(zhì)的外顯子組成，并且發(fā)現(xiàn)SNL處理后有21個circRNAs顯著失調(diào)。通過qPCR分析發(fā)現(xiàn)circAnks1a表達在SNL處理后表現(xiàn)出最顯著的增加。

2、增加circAnks1a可介導(dǎo)疼痛樣超敏反應(yīng)

為了驗證circAnks1a與慢性疼痛有關(guān)，研究人員通過鞘內(nèi)注射的方式將circAnks1a siRNA注射到SNL處理的大鼠體內(nèi)。電生理和疼痛行為分析發(fā)現(xiàn)敲低CircAnks1a可顯著改善SNL誘導(dǎo)的mEPSCs振幅和頻率的增加，并可減弱SNL誘導(dǎo)的機械性異常性疼痛。過表達CircAnks1a則產(chǎn)生相反的結(jié)果。表明脊髓特異性和保守性circAnks1a有助于中樞致敏和行為超敏反應(yīng)，可能是治療慢性疼痛的新靶點。

3、VEGFB促進神經(jīng)元興奮和神經(jīng)性疼痛

為了闡明circAnks1a調(diào)控神經(jīng)性疼痛的分子機制，研究人員將circAnks1a的AAV過表達載體注射到大鼠體內(nèi)，并通過全基因組表達譜芯片分析脊髓背角基因表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有29個轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)，其中VEGFB mRNA的表達表現(xiàn)出最大的增加，并且VEGFB mRNA和蛋白水平在SNL模型中也是顯著增加。此外，VEGFB僅在神經(jīng)元（NeuN）中表達，而在脊髓背角星形膠質(zhì)細胞（GFAP）或小膠質(zhì)細胞（Iba-1）中不表達。通過鞘內(nèi)注射VEGFB siRNA可顯著改善mEPSC振幅和頻率的增加，并減輕了SNL誘導(dǎo)的機械性異位性疼痛。過表達VEGFB則產(chǎn)生相反的結(jié)果。表明VEGFB在神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)性疼痛的發(fā)生過程中起著重要的作用。

4、CircAnks1a調(diào)節(jié)VEGFB在神經(jīng)病理性疼痛中的上調(diào)

研究人員進一步研究了在SNL誘導(dǎo)的慢性疼痛中，VEGFB的上調(diào)是否由circAnks1a介導(dǎo)。結(jié)果顯示circAnks1a與VEGFB共定位，鞘內(nèi)注射circAnks1a siRNA可減少SNL后脊髓背角中VEGFB mRNA和蛋白的上調(diào)。過表達circAnks1a則顯著增加VEGFB mRNA和蛋白質(zhì)水平。表明SNL處理后脊髓背角中VEGFB的上調(diào)依賴于circAnks1a的表達。

5、CircAnks1a促進YBX1的核轉(zhuǎn)位

為了闡明circAnks1a調(diào)節(jié)VEGFB表達的分子機制，研究人員通過RNA pulldown、RIP等實驗證實了circAnks1a與YBX1蛋白之間存在明顯的相互作用，并且在細胞質(zhì)和細胞核中均有結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)SNL處理后，細胞核YBX1的數(shù)量顯著增加，且這一增長與circAnks1a的增長呈現(xiàn)出類似的時間過程。那么circAnks1a是否參與了YBX1的核轉(zhuǎn)位呢？結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低circAnks1a抑制了核YBX1的積累，過表達circAnks1a則顯著增加了核YBX1的水平。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)transportin-1能夠與YBX1相互作用，并介導(dǎo)YBX1的入核。而鞘內(nèi)注射circAnks1a siRNA可顯著減弱這種相互作用。表明circAnks1a通過直接與YBX1相互作用，增強了YBX1與transportin-1的相互作用，從而促進了神經(jīng)損傷后YBX1在背角的核轉(zhuǎn)位。

6、YBX1促進VEGFB上調(diào)

為了探索核YBX1介導(dǎo)VEGFB上調(diào)的機制，研究人員首先預(yù)測了Vegfb基因啟動子區(qū)域中YBX1的潛在結(jié)合位點。ChIP-PCR分析顯示SNL處理后YBX1向Vegfb啟動子的募集顯著增加。隨后的熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實了YBX1與Vegfb啟動子的結(jié)合是功能性的，過表達YBX1可增強熒光素酶活性。

進一步的實驗發(fā)現(xiàn)：抑制circAnks1a的表達顯著降低了YBX1的富集，過表達circAnks1a則增加了YbX1在Vegfb啟動子上的富集。熒光素酶分析也顯示過表達circAnks1a可增強YBX1與Vegfb啟動子的結(jié)合，表明circAnks1a可能直接促進YBX1向Vegfb啟動子的募集。接下來的ChIRP和熒光素酶分析顯示circAnks1a是與Vegfb啟動子的-1834到-1687（promoter region 1）位置強烈結(jié)合。表明細胞核外顯子circAnks1a直接與Vegfb基因結(jié)合，并通過募集YBX1到Vegfb啟動子來促進Vegfb的轉(zhuǎn)錄。

8、CircAnks1a通過miR-324-3p調(diào)控VEGFB的表達

研究人員通過RIP和qPCR分析發(fā)現(xiàn)circAnks1a可能具有吸附miRNA的能力。隨后，通過miRanda預(yù)測、熒光素酶報告基因?qū)嶒灐NA pull-down等確定了miR-324-3p，并且FISH實驗發(fā)現(xiàn)miR-324-3p在神經(jīng)元中表達，與circAnks1a共定位。表明circAnks1a作為miR-324-3p的海綿。

接下來，研究人員還發(fā)現(xiàn)miR-324-3p與VEGFB共定位，并且miR-324-3p可與VEGFB mRNA的3’UTR結(jié)合。體內(nèi)實驗顯示鞘內(nèi)注射miR-324-3p agomir（由銳博生物提供）可顯著降低VEGFB蛋白的增加，但不影響VEGFB mRNA水平，此外還可顯著增加機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。鞘內(nèi)注射miR-324-3p antagomir（由銳博生物提供）則產(chǎn)生相反的結(jié)果，表明CircAnks1a是通過miR-324-3p調(diào)控VEGFB的表達。

原文：Zhang S B, Lin S Y, Liu M, et al. CircAnks1a in the spinal cord regulates hypersensitivity in a rodent model of neuropathic pain[J].?Nature communications, 2019, 10(1): 1-16.