乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球公共衛(wèi)生的沉重負(fù)擔(dān)。盡管通過接種保護(hù)性疫苗已成功降低了HBV感染的新發(fā)病率，但慢性HBV感染約占所有肝細(xì)胞癌（HCC）病例的一半，約占HCC死亡總數(shù)的33%。目前對慢性HBV感染的治療僅限于I型干擾素和核苷酸類似物，但這兩種方法都不能治愈，因?yàn)樗鼈儗Σ《緩?fù)制模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的作用有限。
HBV是一種部分雙鏈松弛環(huán)狀DNA病毒，其基因組為3.2 kb，編碼四個(gè)重疊的開放閱讀框（ORFs）。感染后，HBV松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）轉(zhuǎn)變?yōu)閏ccDNA。cccDNA在細(xì)胞核中積累，與組蛋白和非組蛋白相互作用形成微型染色體，作為實(shí)現(xiàn)病毒RNA轉(zhuǎn)錄的模板。很明顯，一系列組蛋白翻譯后修飾（PTMs），包括活性PTMs H3K4me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K122ac，以及抑制性PTMs H3K9me3和H3K27me3，直接在cccDNA上富集，提供了cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的動(dòng)態(tài)表觀遺傳調(diào)控。最近的研究表明，這些表觀遺傳機(jī)制已被最關(guān)鍵的病毒蛋白HBx采用，以促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)錄。例如，HBx將p300/CBP和PACF募集到cccDNA并乙酰化組蛋白，以促進(jìn)HBV復(fù)制。此外，HBx反式激活HAT1并促進(jìn)cccDNA上的組蛋白乙酰化，以增強(qiáng)cccDNA轉(zhuǎn)錄。然而，既參與cccDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控又受HBV/HBx操縱的宿主因子尚未完全確定。需要進(jìn)一步鑒定這些宿主因子以確定用于HBV治療的藥物靶點(diǎn)。
長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的異質(zhì)性轉(zhuǎn)錄本，具有很少或沒有蛋白質(zhì)編碼潛能，已被證明在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)基因表達(dá)和表觀遺傳修飾。新出現(xiàn)的證據(jù)表明lncRNAs參與介導(dǎo)宿主細(xì)胞與包括HCV和HBV在內(nèi)的多種病毒之間的相互作用。據(jù)報(bào)道，lncRNAs以HBx依賴性方式通過重塑cccDNA微型染色體來調(diào)節(jié)HBV復(fù)制。LncRNA HULC通過調(diào)節(jié)HBx/STAT3/miR-539/APOBEC3B信號(hào)通路激活HBV復(fù)制并加速HCC進(jìn)展。LncRNA HOTAIR與DDX5/PRC2相互作用以抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄，而HBx結(jié)合的lncRNA DLEU2可維持cccDNA和癌癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，鑒定HBx靶向的、且在表觀遺傳上抑制HBV轉(zhuǎn)錄的新型lncRNAs，對于開發(fā)新的HBV治療策略具有重要意義。
近日，Advanced Science（IF16.806）期刊發(fā)表了題為LINC01431 Promotes Histone H4R3 Methylation to Impede HBV Covalently Closed Circular DNA Transcription by Stabilizing PRMT1的研究論文。報(bào)道了一個(gè)可被HBx下調(diào)并抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄的新型HBV限制性lncRNA LINC01431，并揭示了HBx-LINC01431-PRMT1在調(diào)節(jié)HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵調(diào)控作用，暗示其可能是HBV治療的潛在靶點(diǎn)。
首先，為了鑒定負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞中HBV復(fù)制的lncRNAs，研究人員對有或無HBV感染的HLCZ01細(xì)胞（HLCZ01細(xì)胞是一種可支持HBV整個(gè)生命周期的肝癌細(xì)胞系）進(jìn)行了lncRNA測序，結(jié)果在HBV感染的HLCZ01細(xì)胞中總共鑒定出306個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs（60個(gè)上調(diào)和246個(gè)下調(diào)），進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)LINC01431是一種新的被HBx下調(diào)的lncRNA，并且高水平的HBV復(fù)制與低水平的LINC01431相關(guān)。
Fig1. HBV感染期間HBx下調(diào)LINC01431的表達(dá)
接著，為了評(píng)價(jià)LINC01431在HBV復(fù)制中的作用，研究人員通過核質(zhì)分離和RNA FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LINC01431定位于細(xì)胞核。功能獲得性和缺失性實(shí)驗(yàn)顯示，LINC01431過表達(dá)顯著抑制了HBV復(fù)制，而LINC01431敲低則促進(jìn)了HBV復(fù)制，表現(xiàn)為所有檢測到的細(xì)胞中HBV抗原（HBsAg/HBeAg）、HBV病毒粒子和pgRNA的產(chǎn)生增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示LINC01431過表達(dá)顯著降低了HBsAg和HBV DNA的血清水平，以及肝臟HBcAg表達(dá)。證明了LINC01431是HBV復(fù)制的宿主限制因子。
Fig2. LINC01431定位于細(xì)胞核，是HBV復(fù)制的宿主限制因子
隨后，為了詳細(xì)表征LINC01431引發(fā)的HBV抑制，研究人員采用了幾種支持HBV復(fù)制的細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC01431過表達(dá)顯著降低HepaRGNTCP細(xì)胞中的HBV抗原、病毒DNA和RNA，但對cccDNA水平和pgRNA穩(wěn)定性影響不大，提示LINC01431特異性抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄。鑒于組蛋白修飾在cccDNA微型染色體上起著調(diào)控cccDNA轉(zhuǎn)錄的重要作用。因此，研究人員探討了LINC01431是否影響了cccDNA的表觀遺傳修飾。結(jié)果顯示LINC01431過表達(dá)大大降低了包括H3K4me3和H3K27ac在內(nèi)的活性修飾的富集，而LINC01431敲低則顯著增加了對cccDNA結(jié)合的組蛋白的這些修飾。表明LINC01431是一種新型HBV轉(zhuǎn)錄宿主限制因子。
Fig3. LINC01431抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄
機(jī)制研究表明，LINC01431與I型蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMT1）競爭性結(jié)合，以阻斷HBx介導(dǎo)的PRMT1泛素化和降解。因此，LINC01431增加了PRMT1在cccDNA上的占有率，導(dǎo)致H4R3me2a修飾增強(qiáng)和cccDNA結(jié)合的組蛋白乙酰化減少，從而抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄。反過來，為了促進(jìn)病毒復(fù)制，HBV通過HBx介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子ZHX2（鋅指和同源框2）的抑制來轉(zhuǎn)錄抑制LINC01431的表達(dá)。
Fig4. LINC01431與PRMT1相互作用抑制HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄的模型示意圖
總的來說，本研究證明了LINC01431是cccDNA微型染色體的一種新型表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，并強(qiáng)調(diào)了HBx-LINC01431-PRMT1在HBV復(fù)制中的反饋回路，為HBV治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202103135
本研究中使用到的18S、U6、LINC01431 FISH探針&試劑盒、生物素標(biāo)記T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒均由銳博生物提供！更多產(chǎn)品與服務(wù)信息，歡迎登陸銳博生物官方網(wǎng)站查詢或來電咨詢！
