表觀遺傳修飾在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。N6-甲基腺苷（m6A）是最常見和最豐富的RNA修飾之一。越來越多的證據(jù)表明，m6A RNA修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)且可逆的事件。甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A writers），包括m6A甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）、METTL14和WTAP （Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白），以及去甲基轉(zhuǎn)移酶（m6A erasers），包括FTO（脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白）和ALKBH5（alkB同源物5），有助于這種修飾的沉積和去除。m6A修飾可以調(diào)節(jié)mRNA的剪接、翻譯和衰變速率，從而影響細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程。盡管最近的一項(xiàng)研究確定了蛋氨酸-METTL3-m6A軸在多囊腎病中的病理作用，但m6A修飾在腎臟疾病中的作用在很大程度上仍然是未知的。

急性腎損傷（AKI）的定義是腎功能突然下降，并以不受控制的炎癥和程序性細(xì)胞死亡為特征。目前缺乏針對(duì)AKI的特異性和有效的治療方法。之前的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO的DNA甲基化誘導(dǎo)了PPAR-α（過氧化物酶體增殖物激活受體α）中腺苷的m6A甲基化，從而增加了酒精誘導(dǎo)的腎損傷。最近的一項(xiàng)研究也表明，METTL3在缺血/再灌注（I/R）誘導(dǎo)的AKI模型中被誘導(dǎo)。然而，尚未進(jìn)行METTL3在體內(nèi)的功能驗(yàn)證和潛在機(jī)制的分析。

近日，Science Translational Medicine（IF17.956）期刊發(fā)表了題為Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms的研究論文。報(bào)道了METTL3在不同AKI模型的腎小管以及人體活檢和培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞（TECs）中均表達(dá)升高。揭示了METTL3的遺傳和藥理學(xué)抑制通過IGF2BP2依賴性機(jī)制減輕TAB3 m6A修飾，從而減輕腎損傷和炎癥的作用機(jī)制，暗示METTL3/TAB3軸是治療AKI的潛在靶點(diǎn)。

本研究重點(diǎn)探索了m6A RNA甲基化在AKI中的作用。首先，研究人員使用m6A ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)m6A RNA修飾在順鉑誘導(dǎo)的AKI和單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）腎病中顯著升高。對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3、METTL14和WTAP）和去甲基轉(zhuǎn)移酶（FTO和ALKBH5）進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， METTL3在不同AKI模型的腎小管以及人體活檢和培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞（TECs）中均表達(dá)升高，且這種表達(dá)升高是通過c-Jun依賴性機(jī)制誘導(dǎo)的。

Fig1. m6A修飾通過c-Jun依賴性機(jī)制在人類活檢、小鼠模型和響應(yīng)促炎刺激的TECs中增加

接下來，研究人員評(píng)估了METTL3在HK2細(xì)胞中響應(yīng)炎癥刺激的具體功能。結(jié)果顯示，沉默METTL3可減輕TECs在響應(yīng)TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、順鉑和LPS（脂多糖）刺激下的腎臟炎癥和程序性細(xì)胞死亡，而METTL3過表達(dá)則具有相反的效果。條件性敲除小鼠腎臟中的METTL3可減輕順鉑和缺血/再灌注（I/R）誘導(dǎo)的腎功能障礙、損傷和炎癥。

Fig2. METTL3增強(qiáng)經(jīng)促炎刺激處理的HK2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡

此外，研究人員對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎后3天的UUO小鼠腎臟進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）分析。KEGG富集分析表明m6A甲基化與炎癥通路密切相關(guān)。為了確定METTL3在腎臟炎癥中的特異性靶標(biāo)，研究人員對(duì)TNF-α刺激的HK2細(xì)胞（METTL3沉默or未沉默）進(jìn)行MeRIP-seq和RNA-seq分析。MeRIP-seq分析顯示，m6A修飾通常位于共有的“RRACH” motif中（R=G或A，H=A、C或U），并且m6A峰在靠近終止密碼子3’非翻譯區(qū)（3’UTR）附近尤其豐富。KEGG富集分析表明，炎癥相關(guān)信號(hào)通路（如TNF-α通路）與METTL3介導(dǎo)的m6A修飾高度相關(guān)，進(jìn)一步支持了METTL3在炎癥中的作用。另外，在METTL3敲低的情況下，TNF-α刺激的HK2細(xì)胞中顯示有1211個(gè)峰減弱。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析，研究人員將TAB3 [TGF-β活化激酶1 (MAP3K7) 結(jié)合蛋白3] 鑒定為METTL3的靶標(biāo)。

Fig3. 通過MeRIP-seq和RNA-seq鑒定METTL3靶標(biāo)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證METTL3靶向TAB3 mRNA進(jìn)行m6A修飾，研究人員構(gòu)建了含有野生型或突變型TAB3的熒光素酶報(bào)告基因載體，結(jié)果表明TAB3的調(diào)節(jié)受METTL3相關(guān)的m6A修飾的控制。另外，研究人員在METTL3缺陷的HK2細(xì)胞中檢測到TAB3 mRNA的半衰期縮短，暗示TAB3的m6A修飾促進(jìn)其mRNA穩(wěn)定性。進(jìn)一步的RIP實(shí)驗(yàn)、Western blot和RNA穩(wěn)定性分析表明IGF2BP2（胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白2）以m6A依賴性方式提高TAB3 mRNA的穩(wěn)定性。

Fig4. TAB3通過IGF2BP2依賴機(jī)制作為METTL3的靶標(biāo)

接著，研究人員在體外和體內(nèi)構(gòu)建了TAB3敲低模型以探索TAB3的功能作用。結(jié)果顯示TAB3的破壞通過TAK1/TAB2/NF-κB依賴性機(jī)制減弱了TNF-α和順鉑誘導(dǎo)的腎損傷和炎癥反應(yīng)。

Fig5. 沉默TAB3通過TAK1/TAB2/NF-κB依賴性機(jī)制在體外和體內(nèi)減輕炎癥和細(xì)胞凋亡

為了確定METTL3在AKI小鼠模型中的治療潛力，研究人員使用腺相關(guān)病毒9（AAV9）包裹的METTL3敲低質(zhì)粒在小鼠中沉默METTL3。結(jié)果顯示AAV9介導(dǎo)的METTL3沉默減輕了順鉑和LPS誘導(dǎo)的AKI小鼠模型中的腎損傷和炎癥。

Fig6. METTL3敲低可減少AKI小鼠模型中的腎臟炎癥和細(xì)胞凋亡

最后，研究人員使用混合虛擬篩選策略鑒定了一種METTL3抑制劑Cpd-564，并評(píng)估了其腎臟保護(hù)和抗酶活性。結(jié)果顯示，在從ChemDiv（包含430,000種化合物）和MCE（包含100,000種化合物）中篩選出的前100種化合物中，Cpd-564顯示出最好的腎臟保護(hù)作用，并且與先前鑒定的METTL3抑制劑S-腺苷-L-同型半胱氨酸相比，Cpd-564對(duì)順鉑和缺血/再灌注誘導(dǎo)的腎損傷和炎癥具有更好的保護(hù)作用。

Fig7. METTL3抑制劑Cpd-564在體外和體內(nèi)通過抑制METTL3介導(dǎo)的TAB3 m6A RNA甲基化來預(yù)防細(xì)胞損傷和炎癥

總之，本研究結(jié)果表明，METTL3表達(dá)以c-Jun依賴性方式在響應(yīng)各種AKI刺激的TECs中被高度誘導(dǎo)，并且METTL3通過增加TAB3 m6A RNA甲基化促進(jìn)腎臟炎癥和損傷，同時(shí)通過IGF2BP2依賴性機(jī)制增加TAB3 mRNA的穩(wěn)定性。該研究工作闡明了目前尚不清楚的m6A有助于AKI的分子機(jī)制，并表明靶向METTL3/TAB3軸是一種對(duì)抗AKI的潛在策略。

Fig8. METTL3通過IGF2BP2依賴性機(jī)制增強(qiáng)TAB3的m6A RNA甲基化和RNA穩(wěn)定化，從而促進(jìn)腎損傷和炎癥

原文鏈接：

https://www.science.org/doi/abs/10.1126/scitranslmed.abk2709

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