心力衰竭（HF）是一種慢性進行性疾病，是世界性的主要健康問題。它是由冠狀動脈急性或持續(xù)性閉塞引起的心肌梗死（MI）的常見并發(fā)癥。鑒于成人心臟表現(xiàn)出有限的再生能力，科學(xué)家認為對預(yù)防MI后心肌細胞（CMs）丟失的研究可能會降低HF的發(fā)生率。此外，有研究表明circRNA通過充當(dāng)miRNAs海綿與心血管疾病密切相關(guān)。然而，到目前為止，很少有研究關(guān)注circRNA與心肌梗死后HF之間的關(guān)系。近日，Cell Death & Differentiation（IF15.820）期刊發(fā)表了題為Negative feedback of SNRK to circ-SNRK regulates cardiac function post-myocardial infarction的研究論文，報道了一個從心肌細胞（CMs）的SNRK中鑒定的circRNA circ-SNRK，揭示了circ-SNRK與SNRK的負回路可調(diào)節(jié)CMs中的能量代謝，暗示其可能作為心肌梗死后心力衰竭的潛在治療靶點。
CMs中SNRK和circ-SNRK負反饋機制模型示意圖
主要研究結(jié)果
? circ-SNRK的鑒定
首先，研究人員采用左冠狀動脈前降支（LAD）結(jié)扎術(shù)構(gòu)建了大鼠HF模型，并通過超聲心動圖進行證實。根據(jù)超聲心動圖測量結(jié)果，將大鼠分為3組（3只/組）：對照組（Ctrl）、代償組（Comp）和失代償組（Decomp）。并在術(shù)后第4周（Ctrl和Comp組）或第6周（Decomp組）收集心臟。然后分別提取總RNA進行環(huán)狀RNA高通量測序以檢測circRNA的表達。
結(jié)果顯示，在Ctrl、Comp和Decomp組中分別發(fā)現(xiàn)了20044、24081和17470個circRNAs。考慮到Ctrl和Comp大鼠具有相似的心臟功能，因此篩選出923個或1710個組間差異表達的circRNAs（分別為Ctrl vs Decomp組和Comp vs Decomp組）。其中507個circRNAs同時存在于923（55%）和1710（30%）個circRNAs中；507個circRNAs中有98%（498個）在Ctrl和Comp組中表現(xiàn)出相似的表達豐度。此外，有43個circRNAs參與了缺血相關(guān)通路（包括ATP結(jié)合和胰高血糖素信號）。最后，使用FACS檢測細胞凋亡（MI后CMs丟失最常見的方式）來篩選這43個circRNAs，發(fā)現(xiàn)circ-SNRK在CMs中表現(xiàn)出相對較高的表達，并與細胞凋亡密切相關(guān)。
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? circ-SNRK的特性及其對CMs的影響
基于RNA-seq數(shù)據(jù)，源自SNRK外顯子1-2的Circ-SNRK在HF心臟中顯著降低。Sanger測序和RNase R消化驗證了其在CMs中的存在。此外，circ-SNRK在不同器官中表達，位于細胞質(zhì)中，其表達豐度為線性SNRK的~3%，且在多個物種中高度保守?？傊?，circ-SNRK在CMs中富集且高度保守，表明circ-SNRK可能在心臟中發(fā)揮重要作用。
為了研究circ-SNRK的生理功能，分別用pGV486或siRNA上調(diào)或下調(diào)circ-SNRK。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-SNRK可以增加能量生產(chǎn)，改善細胞凋亡，但對細胞自噬和焦亡沒有明顯作用。后續(xù)研究闡明circ-SNRK通過SNRK蛋白作為能量調(diào)節(jié)因子抑制細胞凋亡，因此研究人員主要關(guān)注其能量調(diào)節(jié)因子的生理功能。
??MiR-33通過SNRK將circ-SNRK與ATP合成連接起來
鑒于circ-SNRK位于細胞質(zhì)中，它可能通過其翻譯的多肽或充當(dāng)miRNAs海綿來發(fā)揮其功能。首先，研究人員證實了circ-SNRK不能在CMs中翻譯成肽。然后，發(fā)現(xiàn)miR-33可能是circ-SNRK中存在的7個可能結(jié)合位點的理想候選，并通過雙熒光素酶報告基因、FISH檢測、RIP實驗證實circ-SNRK直接結(jié)合miR-33。
接下來，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-33可以減少CMs中的ATP合成和MMP，而其inhibitor具有相反的作用。此外，mut-circ-SNRK（無miR-33結(jié)合位點）對ATP合成和MMP的影響與pGV486-NC相似，而miR-33 inhibitor可挽救circ-SNRK減少的影響。表明miR-33介導(dǎo)了circ-SNRK對CMs的影響。進一步的實驗證實miR-33直接結(jié)合SNRK 3’UTR以抑制其翻譯。
為了探索miR-33是否通過SNRK調(diào)節(jié)能量產(chǎn)生，研究人員首先測試了SNRK在CM中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNRK可顯著增加ATP產(chǎn)生、MMP和細胞活力，而SNRK的減少具有相反的效果。此外，用miR-33和Ad-SNRK或抑制劑和si-SNRK共轉(zhuǎn)染缺氧處理的NRCMs（新生大鼠心肌細胞）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達SNRK破壞了miR-33對ATP產(chǎn)生的影響，而SNRK的減少抑制了其低表達的影響。表明SNRK介導(dǎo)了miR-33對ATP合成的影響。
最后，為了探索circ-SNRK是否通過SNRK調(diào)節(jié)能量代謝。研究人員通過實驗證實了circ-SNRK可通過miR-33影響SNRK的表達。然后，用pGV486-circ-SNRK和si-SNRK或si-circ-SNRK和Ad-SNRK轉(zhuǎn)染缺氧處理的NRCMs。發(fā)現(xiàn)circ-SNRK過表達對ATP產(chǎn)生的影響被SNRK敲低抑制，而其低表達的影響被SNRK過表達所抵消。以上數(shù)據(jù)表明circ-SNRK可以通過miR-33-SNRK軸影響ATP合成。
??NOVA1促進circ-SNRK形成，直接與側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合
鑒于miR-33可以增加circ-SNRK的水平，且蛋白SNRK是miR-33的靶點，研究人員猜測SNRK是否影響circ-SNRK的環(huán)化以構(gòu)建反饋。qRT-PCR結(jié)果顯示circ-SNRK在CM中被si-SNRK上調(diào)，被Ad-SNRK下調(diào)，提示SNRK在circ-SNRK形成中起作用。
考慮到SNRK與circ-SNRK呈反向變異模式，不應(yīng)直接連接到pre-circ-SNRK，因為直接相互作用會增加circ-SNRK的形成。為了鑒定連接SNRK與circ-SNRK的蛋白質(zhì)，研究人員分析了pre-circ-SNRK的側(cè)翼內(nèi)含子（500 nt）以找到可能的RNA結(jié)合蛋白（RBP）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在篩選出的3個RBPs中，只有si-NOVA1可以降低circ-SNRK的水平。此外，NOVA1過表達的CMs中circ-SNRK的水平增加。表明與蛋白SNRK不同，NOVA1可以促進circ-SNRK的形成。
接下來，通過分析pre-circ-SNRK的側(cè)翼內(nèi)含子，研究人員發(fā)現(xiàn)NOVA1的1個潛在結(jié)合位點在5’內(nèi)含子、3個在3’內(nèi)含子中。進一步的RIP實驗和RNA pull down實驗證實了NOVA1可以與pre-circ-SNRK的側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合并影響circ-SNRK的形成。
為了解決NOVA1是否是circ-SNRK形成的必要條件，研究人員將具有NOVA1結(jié)合位點（wt或mut）的pre-circ-SNRK克隆到質(zhì)粒（pCMV-wt-pre-circ-SNRK、pCMV-mut-pre-circ-SNRK)，然后將其轉(zhuǎn)染到si-NOVA1處理的HEK293中。結(jié)果顯示在這兩種條件下均未觀察到circ-SNRK。然而，隨后的NOVA1過表達僅挽救了 pCMV-wt-pre-circ-SNRK轉(zhuǎn)染的HEK293中的circ-SNRK，暗示NOVA1對于circ-SNRK形成的必要性。此外，Native-PAGE分析顯示NOVA1可以在NRCMs中形成二聚體，推斷NOVA1具有促進circ-SNRK形成的能力。
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??SNRK 55 kDa肽連接NOVA1以影響circ-SNRK形成
研究發(fā)現(xiàn)NOVA1過表達可以挽救Ad-SNRK引起的circ-SNRK降低，而其低表達則相反，表明SNRK通過NOVA1影響circ-SNRK的形成。為了探索潛在的機制，研究人員首先發(fā)現(xiàn)NOVA1 mRNA不受SNRK蛋白的影響。然后，進行了SNRK的co-IP，發(fā)現(xiàn)NOVA1被下拉；但NOVA1下拉肽的分子量為~55 kDa，可被anti-SNRK識別，表明它是蛋白SNRK的一部分。接下來，研究人員在SNRK末端發(fā)現(xiàn)了兩種肽：N端肽（~30 kDa）和C端肽（~55 kDa）。并且發(fā)現(xiàn)蛋白SNRK由催化結(jié)構(gòu)域（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（S_TKc））（N 端 ~30 kDa ）和一系列 LCDs（低復(fù)雜結(jié)構(gòu)域）組成。因此，這個55 kDa的肽屬于SNRK的C端。
SNRK與細胞死亡有關(guān)，并且兩個結(jié)構(gòu)域的連接處含有一個Asp殘基（Caspase底物），暗示SNRK可能被Caspase降解。接下來，研究人員用Z-vad（Caspases全面抑制劑）培養(yǎng)NRCMs，發(fā)現(xiàn)55 kDa肽顯著下調(diào)。隨后，Pull down實驗發(fā)現(xiàn)只有裂解的Caspase 3可以下拉SNRK。最后，通過si-Caspase 3降低了NRCMs中的Caspase 3，并且55 kDa肽的水平隨時間而降低；然而，整個SNRK增加。表明SNRK可以被激活的Caspase 3降解成兩種肽，并且55 kDa肽直接與NOVA1相互作用。
此外，研究人員用pCMV-SNRK或pCMV-55kDa肽轉(zhuǎn)染NRCMs，然后進行Z-vad處理，以探索是否只有55 kDa肽影響circ-SNRK的形成。結(jié)果顯示circ-SNRK僅受55 kDa肽的影響。此外，免疫熒光顯示C端肽位于細胞質(zhì)和細胞核中，而N端肽僅殘留在細胞質(zhì)中，表明只有55 kDa肽可以進入細胞核。進一步的研究顯示55 kDa肽對NOVA1的穩(wěn)定性沒有影響。RIP實驗和Pull down實驗證實了NOVA1與55 kDa肽的相互作用可以抑制NOVA1與內(nèi)含子的結(jié)合。表明SNRK通過其55 kDa肽連接NOVA1影響circ-SNRK的形成。
??缺氧通過NF-κB途徑增加SNRK的轉(zhuǎn)錄
研究表明，缺氧誘導(dǎo)了CMs中pre-SNRK、線性SNRK和circ-SNRK的變化。為了闡明其潛在機制，研究人員分析了缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（TFs），包括HIF、NF-κB或AP-1。為了解決是哪種TF起作用，使用了三種特異性抑制劑：JSH-23（NF-κB）、SP600125（JNK）和2-MeOE2（HIF-1α）。結(jié)果顯示，僅在JSH-23處理下，缺氧處理的CMs中pre-SNRK水平顯著降低。生信分析顯示SNRK啟動子中有三個可能的NF-κB結(jié)合位點。因此，研究人員猜測缺氧可能通過NF-κB途徑影響SNRK的轉(zhuǎn)錄。
然后，使用pCMV-P65（NF-κB復(fù)合物中最豐富的元件）上調(diào)P65的水平。共聚焦顯微鏡下p（磷酸化）-P65的免疫熒光顯示，pCMV-P65轉(zhuǎn)染的NRCMs中核P65增加。NRCMs中pre-SNRK的顯著增加證實了NF-kB復(fù)合物可以激活SNRK轉(zhuǎn)錄；si-P65轉(zhuǎn)染的NRCMs中pre-SNRK的減少進一步支持了這一觀點。
接下來，研究人員設(shè)計了三條靶向啟動子中P65預(yù)測位點的引物。P65的CHIP實驗顯示來自第2個位點的序列可以被檢測到。隨后，進一步將SNRK的wt或mut啟動子克隆到pGL 4.27載體中。發(fā)現(xiàn)pCMV-P65和pGL 4.27-wt-SNRK啟動子共轉(zhuǎn)染CMs的熒光強度顯著高于對照組。最后，研究發(fā)現(xiàn)在缺氧處理的CMs中或MI后的心臟中P65的增加，表明pre-SNRK過表達與心臟中的P65相關(guān)。最重要的是，研究證實了缺氧可以通過NF-κB途徑激活SNRK的轉(zhuǎn)錄。
??Circ-SNRK改善MI誘導(dǎo)大鼠的心臟功能
最后，為了探索circ-SNRK是否可以改善體內(nèi)MI后的心臟功能。研究人員構(gòu)建了circ-SNRK過表達（MI-circ-SNRK組）或不表達（MI-Control組）的HF大鼠模型。結(jié)果顯示MI-circ-SNRK組中circ-SNRK水平顯著上調(diào)，心肌梗死面積明顯減小。此外，MI-circ-SNRK組的超聲心動圖指標(biāo)（LVEF、FS、LVPW）均較高，說明circ-SNRK過表達大鼠心臟功能較好。進一步的實驗顯示MI-circ-SNRK組中ATP和ATP/ADP比率升高，證實了其在能量代謝中的有益作用。另外，circ-SNRK可以改善體內(nèi)細胞死亡。最后，研究人員探索了體內(nèi)circ-SNRK是否通過SNRK發(fā)揮其功能。結(jié)果顯示SNRK和相關(guān)蛋白（Trib3、PPARα、UCP3）的表達如預(yù)期的那樣發(fā)生了改變。同時，在不同組中未觀察到miR-33的變化，這與體外結(jié)果一致。表明circ-SNRK可以通過miR-33-SNRK軸保護心臟免受能量耗竭，進而改善MI后的心臟功能。
總之，本研究結(jié)果表明NOVA1可以加速與circRNA可變剪接因子相關(guān)的circRNA的形成，擴展了circRNA形成的理解，并指導(dǎo)了circRNA未來的研究方向。蛋白SNRK和circ-SNRK之間的反饋回路將SNRK的表達豐度限制在一個適當(dāng)?shù)乃?；分別通過P65和Caspase 3雙向調(diào)節(jié)蛋白SNRK的缺氧，共同表明蛋白SNRK在MI后心臟功能的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。外源性circ-SNRK的引入在體外通過SNRK改善了細胞凋亡并減少了體內(nèi)CMs的丟失，暗示circ-SNRK可能是未來HF的新治療靶點。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41418-021-00885-x
本研究涉及到的circRNA高通量測序服務(wù)（circRNA-seq）、miRNA mimic/inhibitor、siRNA產(chǎn)品均由銳博生物提供！
