在前列腺癌（PCa）患者中，骨病變在射線照片中表現(xiàn)為成骨細(xì)胞樣；然而，PCa患者經(jīng)常發(fā)生病理性骨折，并且在組織病理學(xué)評估下所有轉(zhuǎn)移性病變均可觀察到骨吸收。平衡PCa患者成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性的機(jī)制尚不清楚。近日，Journal of Extracellular Vesicles（IF25.842）期刊在線發(fā)表了題為Exosomes derived from osteogenic tumor activate osteoclast differentiation and concurrently inhibit osteogenesis by transferring COL1A1-targeting miRNA-92a-1-5p的研究論文。揭示了成骨腫瘤外泌體通過轉(zhuǎn)移靶向COL1A1的miRNA-92a-1-5p來促進(jìn)破骨細(xì)胞分化并抑制成骨發(fā)生的作用機(jī)制，為PCa骨轉(zhuǎn)移提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
模型示意圖：PCa外泌體通過轉(zhuǎn)移miR-92a-1-5p和靶向COL1A1來調(diào)節(jié)骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)、骨ECM重塑和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成
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主要研究結(jié)果
? 成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和混合PCa細(xì)胞的外泌體特征
PCa細(xì)胞系通常分為三組：成骨細(xì)胞系、溶骨細(xì)胞系和混合細(xì)胞系。MDA PCa 2b細(xì)胞在植入小鼠脛骨后表現(xiàn)出PCa細(xì)胞的成骨細(xì)胞表型并誘導(dǎo)成骨。另外兩種PCa細(xì)胞系PC3和DU145在骨轉(zhuǎn)移中誘導(dǎo)溶骨性病變。具有混合表型的PCa細(xì)胞系LNCap及其衍生物C4-2/C4-2B可產(chǎn)生混合病變。
因此，研究人員分離了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和混合PCa細(xì)胞中的外泌體，并使用TEM和NTA對其進(jìn)行表征。發(fā)現(xiàn)從MDA PCa 2b、C4-2、PC3和LNCap AI+F細(xì)胞中分離得到的外泌體均勻，呈卵形，大小大多數(shù)分布在~ 90-130 nm范圍內(nèi)。并通過western blotting檢測外泌體標(biāo)志物證實(shí)了囊泡就是外泌體。此外，PCa細(xì)胞和正常前列腺細(xì)胞（RWPE-1）之間的外泌體產(chǎn)量存在顯著差異，PCa細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體比正常前列腺細(xì)胞多出約3倍。
??PCa外泌體靶向骨并在體內(nèi)被骨基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化
為了闡明PCa外泌體的作用，首先確定PCa外泌體在體內(nèi)的分布和代謝是至關(guān)重要的。因此，研究人員將Vybrant DID標(biāo)記的外泌體通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示體內(nèi)熒光信號僅在PCa-Exos組的骨骼中觀察到，而在未定位到骨骼的RWPE-1 Exos組中則未觀察到，說明該骨靶點(diǎn)是PCa特異性的。并且PCa-Exos組的平均熒光強(qiáng)度在24和48h顯著升高，在24h達(dá)到峰值，然后在48h后急劇下降。以上結(jié)果表明，相對于正常外泌體，PCa衍生的外泌體表現(xiàn)出較高的骨特異性靶向傾向。
接下來，為了確定觀察到的熒光是否來自于內(nèi)化了熒光標(biāo)記外泌體的細(xì)胞。研究人員通過流式細(xì)胞術(shù)檢測長骨沖出的骨髓細(xì)胞熒光信號，發(fā)現(xiàn)MDA PCa 2b-Exos組的熒光水平高于Vybrant DID組，表明紅色熒光來自于內(nèi)化了PCa外泌體的骨髓細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定吸收外泌體的骨髓細(xì)胞類型，研究人員使用anti-OCN/RANKL/CTSK/TRAP（綠色）對骨骼進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。結(jié)果顯示標(biāo)記的外泌體的熒光與來自成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的信號（白色箭頭指示）共定位，這證實(shí)了尾靜脈注射后PCa外泌體被骨基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化。
??PCa外泌體被Raw264.7細(xì)胞迅速內(nèi)化并促進(jìn)體外破骨細(xì)胞分化
基于在骨和骨基質(zhì)細(xì)胞中檢測到的PCa外泌體的器官向性，研究人員探索了PCa外泌體是否參與了破骨細(xì)胞分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100ng/ml RANKL（在破骨細(xì)胞分化中起重要作用）培養(yǎng)2天后，再用MDA PCa 2b CM培養(yǎng)48h，Raw264.7細(xì)胞（破骨前體細(xì)胞，常用于破骨細(xì)胞生成）的破骨細(xì)胞分化增加，但這種效果被GW4869（一種外泌體抑制劑）逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)MDA PCa 2b外泌體可被Raw264.7細(xì)胞迅速內(nèi)化。
此外，研究人員使用Raw264.7細(xì)胞和BMMs這兩種常用的破骨細(xì)胞分化模型進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和混合PCa細(xì)胞衍生的外泌體均可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，無論RANKL是否存在。
??PCa外泌體在體外抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨發(fā)生
為了進(jìn)一步分析觀察到的骨基質(zhì)細(xì)胞外泌體內(nèi)化，研究人員檢查了MC3T3-E1細(xì)胞（一種小鼠成骨前體細(xì)胞系，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可分化成成熟的成骨細(xì)胞）的分化，以研究外泌體對成骨細(xì)胞的潛在影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37℃下孵育時(shí)，PCa細(xì)胞來源的外泌體被MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)化；當(dāng)細(xì)胞在4℃下孵育時(shí)，內(nèi)化受到抑制，這表明受體細(xì)胞對外泌體的攝取是一個(gè)生物活性過程。接下來，將外泌體與細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞標(biāo)志物Alp、Ocn、Runx2和Osx的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，表明MDA PCa 2b外泌體抑制了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨發(fā)生。此外，茜素紅S染色顯示當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞與MDA PCa 2b外泌體在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成能力顯著降低。另外，與ALP mRNA表達(dá)一致，MDA PCa 2b外泌體培養(yǎng)后，ALP染色降低。進(jìn)一步表明PCa外泌體可抑制成骨發(fā)生。
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??成骨腫瘤來源的外泌體在體內(nèi)誘導(dǎo)骨溶解
考慮到PCa外泌體在體外骨穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，那么PCa衍生的外泌體是否影響體內(nèi)骨形成和骨溶解。為了解決這個(gè)問題，研究人員將PBS、PCa外泌體或正常外泌體（10ug）通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，然后采集脛骨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。micro-CT分析顯示，MDA PCa 2b Exos組右側(cè)脛骨的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著低于對照組，而MDA PCa 2b Exos組骨干的BS/BV和Tb.Sp顯著升高。表明經(jīng)尾靜脈注射MDA PCa 2b外泌體后，骨發(fā)生骨溶解。此外，3D重建模型顯示外泌體注射4周后發(fā)生脛骨小梁分離。左側(cè)脛骨TRAP染色和OCN免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示MDA PCa 2b Exos組破骨細(xì)胞數(shù)量增加，成骨細(xì)胞數(shù)量減少。
注射4周后，改變注射策略，每周注射一次更大劑量的外泌體（50ug），在第42天和第56天采集脛骨并進(jìn)行micro-CT分析。結(jié)果顯示，與對照組和RWPE-1 Exos組相比，MDA PCa 2b Exos組在三個(gè)指示時(shí)間點(diǎn)均檢測到骨丟失。同樣地，C4-2和PC3外泌體也可誘導(dǎo)骨溶解。這些結(jié)果證實(shí)了小劑量注射來自成骨、破骨或混合PCa細(xì)胞（不借助腫瘤細(xì)胞）的PCa外泌體可以顯著誘導(dǎo)模型小鼠的骨溶解并減少骨形成。
??PCa外泌體加速骨腫瘤生長
為了確定PCa外泌體是否能加速骨腫瘤的生長，研究人員在骨髓培養(yǎng)4周后，將慢病毒載體（GFP-Puro-Luc）感染的MDA PCa 2b細(xì)胞注射到BALB/C裸鼠右側(cè)脛骨，然后在注射后第1天至第56天進(jìn)行體內(nèi)成像。結(jié)果顯示，直到第49天和第56天，僅在MDA PCa 2b組中可檢測到生物發(fā)光，這表明對腫瘤外泌體的預(yù)培養(yǎng)加速了骨骼中的腫瘤生長。在第49天和56天，對各組腫瘤負(fù)荷進(jìn)行量化發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均檢測到生物發(fā)光，M-Exos+M-Cells組生物發(fā)光強(qiáng)度急劇增加，表明腫瘤細(xì)胞的生長被加速了。在第56天處死MDA Exos組小鼠時(shí)，micro-CT三維重建圖像檢測到骨腫瘤，H&E染色顯示骨中存在前列腺腫瘤。
??MDA PCa 2b外泌體轉(zhuǎn)移的miRNA影響骨穩(wěn)態(tài)
接下來，研究人員使用下一代測序技術(shù)來分析MDA PCa 2b外泌體中的小RNAs是否會(huì)影響骨穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)展。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MDA PCa 2b外泌體中有18個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，30個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。接下來，重點(diǎn)研究了三種特定的miRNAs（miR-92a-1-5p、miR-375和miR-148a-3p）。qPCR分析顯示miR-92a-1-5p、miR-375和miR-148a-3p在MDA PCa 2b外泌體中的表達(dá)水平高于RWPE-1外泌體。此外，過表達(dá)miR-92a-1-5p可抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化，而過表達(dá)miR-148a-3p或miR-375促進(jìn)了成骨分化。
接下來，研究人員對這三個(gè)miRNAs的靶基因進(jìn)行KEGG分析，共鑒定出22條通路。考慮到這3種miRNAs在骨穩(wěn)態(tài)中的不同作用，選擇了8種潛在的功能通路：RNA降解、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與受體的相互作用、膀胱癌、p53信號通路、胞吞作用、FOXO信號通路、賴氨酸降解和病毒致癌。結(jié)果確定了8個(gè)通路中的154個(gè)基因作為3個(gè)miRNAs的潛在靶基因。為了揭示這些靶基因的潛在功能，研究人員進(jìn)行了KEGG和GO富集分析。發(fā)現(xiàn)這些靶基因在FOXO信號通路、血管生成、外泌體生物合成、細(xì)胞增多和癌癥相關(guān)通路中富集。表明由PCa外泌體遞送的miRNAs通過多種潛在途徑和靶基因強(qiáng)烈而廣泛地影響骨穩(wěn)態(tài)。
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??MDA PCa 2b外泌體轉(zhuǎn)移的miR-92a-1-5p通過靶向COL1A1促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化
最后，研究人員探索了miR-92a-1-5p（檢測到的最豐富的miRNA）在骨穩(wěn)態(tài)和腫瘤發(fā)展中的確切作用。首先，為了確定miR-92a-1-5p在破骨細(xì)胞/成骨細(xì)胞分化中的作用，使用miRNA mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞/MC3T3-E1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-92a-1-5p促進(jìn)破骨細(xì)胞分化/抑制成骨細(xì)胞分化，anti-miR-92a-1-5p抑制破骨細(xì)胞分化/促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。接下來，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示Lv-92a-1-5p 組的總腫瘤負(fù)荷較高，并且在Lv-92a-1-5p組的骨骼中觀察到腫瘤負(fù)荷升高，而前列腺中的腫瘤負(fù)荷沒有顯著增加。此外，通過體外成像和PSA免疫熒光標(biāo)記也證實(shí)了腫瘤骨轉(zhuǎn)移。
為了揭示miR-92a-1-5p調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制，研究人員使用在線miRNA預(yù)測軟件鑒定了COL1A1（編碼I型膠原）作為miR-92a-1-5p的靶基因。在轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p后，COL1A1 mRNA水平在MC3T3-E1細(xì)胞中沒有明顯改變，而在Raw264.7細(xì)胞中則明顯降低；COL1A1蛋白水平在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-92a-1-5p的MC3T3-E1和Raw264.7細(xì)胞中下降。此外，生物信息學(xué)分析及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了COL1A1是miR-92a-1-5p的直接靶點(diǎn)。MC3T3-E1和Raw264.7細(xì)胞中I型膠原表達(dá)水平顯著降低進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)果。
為了進(jìn)一步證明COL1A1敲低在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化中的作用，研究人員使用Col1a1 siRNA來敲低COL1A1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Col1a1 siRNA后Raw264.7細(xì)胞中的Ctsk和Trap mRNA表達(dá)上調(diào)，Trap+破骨細(xì)胞數(shù)量增加；此外，MC3T3-E1細(xì)胞中的Alp和Runx2 mRNA表達(dá)下調(diào)；ALP染色和ALP活性也降低。
為了檢測MDA PCa 2b細(xì)胞的外泌體是否可以在體內(nèi)降低COL1A1表達(dá)，研究人員將MDA PCa 2b外泌體注射到裸鼠體內(nèi)，每周3次，持續(xù)4周，然后收獲脛骨并檢查COL1A1水平。發(fā)現(xiàn)COL1A1表達(dá)明顯下調(diào)。此外，還測量了骨髓培養(yǎng)4周后收獲的脛骨中I型膠原的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA PCa 2b治療組的I型膠原標(biāo)記強(qiáng)度低于對照組。
綜上所述，這些結(jié)果表明PCa外泌體來源的miR-92a-1-5p破壞骨穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)PCa腫瘤骨轉(zhuǎn)移；此外，還揭示了以下潛在機(jī)制：miR-92a-1-5p和含有miR-92a-1-5p的MDA PCa外泌體能夠靶向COL1A1并加速骨ECM降解。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12056
本研究中使用到的外泌體Small RNA測序服務(wù)、miRNA qPCR引物、miRNA mimic/inhibitor及其NC對照、
轉(zhuǎn)染試劑盒、COL1A1 siRNA及其NC對照產(chǎn)品均由銳博生物提供！
