外泌體研究首先要求我們提取出高質(zhì)量且功能和結(jié)構(gòu)完整的Exosome，隨后需要對分離的外泌體進行鑒定，以證明得到的產(chǎn)物是外泌體。接下來就可以對鑒定的外泌體進行下一步的測序或功能研究了。因此，外泌體提取和鑒定是外泌體研究至關(guān)重要的步驟。

今天，小編要給大家推薦的就是銳博生物推出的外泌體抽提與鑒定技術(shù)服務(wù)，結(jié)合自主專利外泌體抽提技術(shù)，提供更加專業(yè)化的服務(wù)支持，檢測結(jié)果真實可靠，讓您的外泌體研究事半功倍！

技術(shù)服務(wù)內(nèi)容：

對樣品外泌體抽提樣本進行Exosome粒徑檢測和流式細(xì)胞儀表面標(biāo)記物檢測。

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01. Exosomes提取【自主專利產(chǎn)品、客戶文章1600+篇】

采用新型Exosomes提取工具–Ribo? Exosome Isolation Reagent，可從細(xì)胞上清、血清血漿或其他體液中獲取大量結(jié)構(gòu)和功能完整的Exosome。

HeLa 細(xì)胞上清經(jīng)Ribo?Exosome Isolation Reagent 抽提，用攜帶熒光基團的CD63 和CD81 抗體分別與抽提前樣本及抽提產(chǎn)物進行免疫反應(yīng)，使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。結(jié)果表明，抽提前兩個標(biāo)志物抗體熒光強度均處于背景閾值范圍內(nèi)，抽提后熒光強度明顯提升，呈現(xiàn)陽性結(jié)果，表明exosomes 被富集出來。

02. 粒徑檢測

Zetasizer 儀器根據(jù)Stokes-Einstein 原理，使用動態(tài)光散射檢測由于顆粒布朗運動而產(chǎn)生散射光的波動隨時間的變化。檢測器將散射光信號轉(zhuǎn)化為電流信號，再通過數(shù)字相關(guān)器的運算處理，得到顆粒在溶液中擴散的速度信息，即擴散系數(shù)。該體系適用于所有能夠穩(wěn)定存在于溶液中作布朗運動的顆粒，典型體系包括：乳液、有機/無機顆粒、自然/合成高分子溶液、表面活性劑、病毒、蛋白質(zhì)樣品等。

H460細(xì)胞上清經(jīng)Ribo Exosomes Isolation Reagent抽提，Zetasizer Nano ZS 納米粒度儀檢測粒徑分布。

（注：實際檢測結(jié)果受不同樣本來源、樣本的純度等因素的影響，圖片僅供參考）

03. 表面標(biāo)記物檢測

Exosome表面保留有較完整的抗原，可使用熒光直標(biāo)是特異性單克隆抗體孵育Exosome，再用流式細(xì)胞儀進行檢測，根據(jù)所測定的熒光強度即可知其 表面抗原分布的情況。從而實現(xiàn)Exosome表面抗原檢測。Exosomes常見的特異性標(biāo)記蛋白為CD63和CD81，使用熒光直標(biāo)的CD63和CD81抗體結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)能夠大致檢測出樣品含有CD63和CD81的情況。（特別提醒：流式鑒定提供的是人源CD63和CD81，其他物種或其他表面標(biāo)志蛋白需客戶提供直標(biāo)抗體）

H460細(xì)胞上清經(jīng)Ribo Exosomes Isolation Reagent抽提，流式鑒定Exosomes表面標(biāo)志物CD63和CD81。

（注：實際檢測結(jié)果受不同樣本來源、樣本的純度等因素的影響，圖片僅供參考）

項目流程：

售前咨詢→銷售提交合同審核→客戶簽訂合同→客戶送樣→啟動項目→完成項目后反饋銷售→發(fā)送實驗報告

樣本類型：

1. 原始樣本（血清、血漿、細(xì)胞上清）

2. 提取好的外泌體

* 干冰送樣，不要反復(fù)凍融！

項目周期：

1. 客戶提供血清、血漿、細(xì)胞上清等原始樣本，周期一般15個工作日

2. 客戶提供提取好的外泌體，周期一般10個工作日（正常情況下1周內(nèi)即可出具實驗報告）

服務(wù)特點：

1. 自主專利Exosomes提取試劑盒，廣泛適用于細(xì)胞上清、血清血漿或其他體液

2. 提供外泌體提取與鑒定一站式服務(wù)，性價比高

3. 合理的項目周期，快至1周內(nèi)可出具實驗報告

4. 檢測結(jié)果真實唯一，提供實驗原始數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確可靠

5. 優(yōu)質(zhì)的服務(wù)體驗，提供專人專項售前售中售后技術(shù)解答

客戶案例：

Cerebrovascular Diseases丨Diagnosis of Hyperacute and Acute Ischaemic Stroke The Potential Utility of Exosomal MicroRNA-21-5p and MicroRNA-30a-5p

納米顆粒跟蹤分析：分離的外泌體的粒徑分布由Ribobio Co.LTD (Guangzhou, China)使用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS進行檢測。簡要地說，將1 mL無外泌體的PBS添加到重懸的外泌體中，并將混合物緩慢注入干凈的無顆粒樣品池中，避免形成氣泡。將樣品池蓋好并放入儀器中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進行操作即可。

流式細(xì)胞術(shù)分析：外泌體用CD63或CD81抗體熒光標(biāo)記。將100μl無外泌體的PBS加到重懸的外泌體中。隨后，將混合物在20μL抗體（CD63或CD81）中孵育。未標(biāo)記的樣品作為陰性對照。然后由Ribobio Co. LTD使用accuriC6 flow cytometer進行檢測。

Wang W, et al. Cerebrovascular Diseases, 2018, 45(5-6): 204-212.

結(jié)果展示：

分析報告顯示，80％的顆粒大小在20-200nm之間（圖c），在外泌體的預(yù)期大小范圍內(nèi)。

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CD63和CD81的陽性率分別為80.6％和91.7％。陰性對照的陽性率為5.7％（圖1d），證實了它們是外泌體。

J Cell Mol Med丨MicroRNA-30a ameliorates hepatic fibrosis by inhibiting Beclin1-mediated autophagy

外泌體的分離和鑒定：LX-2細(xì)胞在含有10％無外泌體FBS的DMEM中培養(yǎng)。使用Ribo? Exosome Isolation Reagent (for cell culture media) (RiboBio, Guangzhou, China)提取LX-2外泌體。然后使用Accuri C6流式細(xì)胞儀分析了外泌體標(biāo)志物CD63和CD81。用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS檢測了外泌體的粒徑。

Chen J, et al. Journal of cellular and molecular medicine, 2017, 21(12): 3679-3692.

結(jié)果展示：

FCM分析（圖D）和粒徑檢測（圖E）顯示LX-2外泌體表達(dá)外泌體標(biāo)記物（CD63和CD81），直徑范圍為20-200nm。

Exosome送樣建議：

注意：分離exosome前的樣品不能加入任何RNA保護劑（如Trizol，RNA later）

送樣須知：

1. 血清樣品

1）采血后，輕輕將全血滴入潔凈的EP管或者離心管

2）室溫下靜置3~4小時，可見血塊析出（也可放置4度冰箱過夜）

3）5000rpm，離心10min，可見淡黃色血清，取出上清后可再3000rpm離心10min，以最大程度保證血清質(zhì)量

4）將血清分裝，送樣前可凍存于-80度

提示：送樣量最好2mL以上

2. 血漿樣品（不能用肝素抗凝）

1）用采血針和抗凝管（含EDTA）抽取全血，混勻

2）室溫下靜置3~4小時（也可放置4度冰箱過夜），5000rpm，離心5min，取上清即為血漿

3) 可將血漿分裝，送樣前可凍存于-80度

提示：送樣量最好4mL以上

3. 細(xì)胞上清

需要提前預(yù)備的實驗材料：去除Exosome的血清（自己制備或購買）

1）培養(yǎng)皿的細(xì)胞匯合率達(dá)到80%~90%時

2）把原有培養(yǎng)基吸掉，加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行）進行消化

3）細(xì)胞變圓后加入等體積的含正常血清培養(yǎng)基終止消化

4）用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來

5）1100rpm，離心5分鐘

6）吸掉上清液，用無Exosome血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次

7）1100rpm，離心5分鐘

8）吸掉上清液，加入Exosome血清的培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞

9）根據(jù)細(xì)胞種類把細(xì)胞傳到幾個培養(yǎng)皿中（收集上清時細(xì)胞匯合率為60%~80%），繼續(xù)培養(yǎng)

10）培養(yǎng)48h~72h后，收集細(xì)胞上清

11）2000rpm，離心10min，然后10000rpm, 離心30min, 去除細(xì)胞或者細(xì)胞碎片，取上清即可

提示：送樣量最好20mL以上

4. 尿液

1）用15mL離心管收集尿液

2）2500~3000rpm，離心15min，去除細(xì)胞，取上清

3）送樣前可凍存于-80度

提示：送樣量最好10mL以上

委托技術(shù)服務(wù)：

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